Серологические методы исследований выявления специфических AT и Аг возбудителя - важный инструмент в диагностике инфекционных заболеваний. Особую ценность они имеют в тех случаях, когда выделить возбудитель не представляется возможным. При этом необходимо выявить повышение титров AT, в связи с чем исследуют парные образцы сыворотки, взятые в интервале 10-20 сут (иногда этот интервал может быть более длительным). AT обычно появляются в крови на 1-2-ю неделю заболевания и циркулируют в организме относительно долго, что позволяет использовать их выявление для ретроспективных эпидемиологических исследований. Определение классов Ig чётко характеризует этапы инфекционного процесса, а также может служить косвенным прогностическим критерием, Особое значение имеют методы выявления микробных Аг. В значимых количествах они появляются уже на самых ранних сроках, что делает их идентификацию важным инструментом экспресс-диагностики инфекционных заболеваний, а количественное их определение в динамике инфекционного процесса служит критерием эффективности проводимой антимикробной терапии.
Аллергологические методы исследования
Антигены многих возбудителей обладают сенсибилизирующим действием, что используют для диагностики инфекционных заболеваний, а также при проведении эпидемиологических исследований. Наибольшее распространение нашли кожно-аллергические пробы, включающие внутри-кожное введение Аг (аллергена) с развитием реакции ГЗТ. Кожные пробы нашли применение в диагностике таких заболеваний как сап, мелиоидоз, бруцеллёз. Наиболее известна проба Манту, используемая как для диагностики туберкулёза, так и для оценки невосприимчивости организма к возбудителю.
АЛЛЕРГОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Удельный вес аллергических заболеваний в патологии человека неуклонно возрастает. Важную роль в их диагностике отводят анамнезу клиническим исследованиям больного. Haряду с этим все шире начинает применяться постановка аллергических проб с бактериальными и небактериальными аллергенами. Выбор метода кожного тестирования зависит от типа повышенной чувствительности, вида аллергена, степени сенсибилизации, возраста.
Среди экзогенных неинфекционных аллергенов особое значение в практике стоматолога имеют медикаменты. Очень часто отмечается повышенная чувствительность к антибиотикам. Воздействие этих аллергенов вызывает, как правило, реакцию немедленного типа. Для диагностики лекарственной аллергии в некоторых клиниках применяют кожные пробы. Кожные пробы с лекарствами (особенно с антибиотиками) следует проводить осторожно, так как у больных с гиперсенсибилизацией может развиться тяжелая реакция - анафилактический шок. Начинать надо с малочувствительной капельной пробы. При получении отрицательной капельной пробы затем проводят скарификационную, аппликационную и внутрикожную. Если скарификационная кожная проба дает положительный результат, то дальнейшее исследование прекращают.
Методика капельных кожных проб. Кожу сгибательной поверхности предплечья протирают спиртом или смесью спирта с эфиром. Капли испытуемого лекарства и контрольного раствора наносят на расстоянии 5 см. При повышенной чувствительности через несколько минут на месте нанесения лекарства появляются зуд, отечность, гиперемия.
Методика скарификационных кожных проб. На обработанную спиртом кожу предплечья наносят капли медикамента и контрольной жидкости (растворитель, изотонический раствор хлорида натрия). Оспопрививательным скальпелем делают линейные надрезы (по 5 мм) в месте нанесения капель (не допускать появления крови). Выдерживают несколько минут и ватными тампонами удаляют остатки раствора, после чего учитывают немедленные (через 15-20 мин) и замедленные (через 24 ч) кожные реакции. Появление папулы (до 3 мм и более), а также гиперемии, везикулезных высыпаний, реакции со стороны регионарных лимфатических узлов расценивается как положительная реакция. На контрольном участке предплечья видна только полоска.
Методика аппликационных кожных проб. Сложенную в четыре слоя марлю (2 х 2 см) пропитывают раствором испытуемого вещества в концентрации, не вызывающей в норме раздражения кожи. На обезжиренную сухую кожу (обычно предплечья) накладывают эту марлю, а рядом при точно таких же условиях - марлю, пропитанную растворителем. Каждый участок накрывают сверху целлофаном и фиксируют пластырем. Результаты проб учитывают через 24-48 ч. Положительная реакция характеризуется появлением дерматита. Недостаток такой пробы - возможное отсутствие реакции кожи при повышенной чувствительности слизистой оболочки рта.
Методика внутрикожной пробы. Внутрикожные пробы в стоматологической практике применяются в основном для выявления сенсибилизации к бактериальным аллергенам. Наиболее часто при этом используются аллергены гемолитического стрептококка, гемолитического стафилококка, кишечной палочки, вульгарного протея, которые получают в готовом виде. Внутреннюю поверхность предплечья обрабатывают спиртом и эфиром. Короткой тонкой иглой внутрикожно вводят 0,1 мл аллергена, содержащего 4 кожные дозы. Кожно-аллергические реакции учитываются через 24-48 ч. При положительной реакции через 24 ч на месте введения аллергена возникают гиперемия и инфильтрат. Величина реакции расценивается следующим образом: резкоположительная реакция (+ + + +)-гиперемия, инфильтрат диаметром не менее 30 мм, болезненность при пальпации; положительная реакция (+ + +)-размер очага 21-29 мм и менее выраженная болезненность; слабоположительная реакция (+ +)-очаг размером 15-20 мм со слабым отеком; сомнительная реакция (+) -очаг размером 10-15 мм. При резко-положительной или положительной реакции на один аллерген у больного признается моноаллергия к данному аллергену, на два или более - полиаллергия. Повторное внутрикожное введение бактериальных аллергенов не рекомендуется проводить чаще 1 раза в месяц.
Безопасны методы диагностики аллергических состояний, проводимые вне организма (in vitro). Наиболее распространенными являются реакции лейкоцитолиза и лейкергии, базофильный тест, показатель повреждаемости нейтрофилов.
Реакция лейкоцитолиза основана на выявлении деформирующего действия бактериальных аллергенов на лейкоциты периферической крови. Специфический аллерген деформирует и разрушает 14% и больше нейтрофилов, неспецифическая деформация (контроль) не превышает 10%. Интенсивность кожных реакций и процент деформации нейтрофилов в реакции лейкоцитолиза находятся в прямой зависимости (60-80). Деформация более 35% нейтрофилов соответствует резкоположи-тельной реакции при кожной пробе, 25-34% - положительной реакции.
Аллергологический метод исследования (АЛМИ) используется для выявления в организме Ат или сенсибилизированных Т-лимфоцитов к аллергену.
Задачи АЛМИ:
диагностика хронических инфекционных заболеваний, в патогенезе которых имеет место сенсибилизация к микробным антигенам (ГЗТ);
диагностика аллергических заболеваний (ГНТ);
разработка специфической десенсибилизирующей терапии реакций ГНТ медиаторного типа.
Этапы АЛМИ:
I этап алми. Сбор аллергологического анамнеза с целью:
установления наследственной предрасположенности к аллергии;
выявления факторов, отягощающих личный аллергологический анамнез:
– перенесенных острых заразных и инфекционных заболеваний;
– наличия в данное время или в анамнезе хронических воспалительных заболеваний (хронический тонзиллит, синусит, ринит, холецистит, колит, хронические язвы кожи, микробная экзема, фурункулёз, кожные грибковые заболевания);
– выявление пищевой аллергии, ингаляционной аллергии, инсектной аллергии, контактных дерматитов;
– получение сведений о профилактических прививках и реакциях на них;
– получение сведений о введении гетерологичных сывороток и реакциях на них;
– получение сведений о реакциях на введение антибиотиков, частоте применения антибиотиков, сведения о непереносимости других лекарств.
установление эффекта элиминации аллергена: связи между контактом с аллергеном и изменением состояния пациента.
Так, аллергию к клещам домашней пыли можно заподозрить при развитии обострений, связанных с уборкой помещения, работе с книгами. При смене места проживания выраженность симптомов часто уменьшается, иногда вплоть до полной клинической ремиссии, в виду отсутствия контакта с аллергенным триггером.
При аллергии на производственные аллергены наблюдается ухудшение состояния после выходных («эффект понедельника»).
При лекарственной аллергии отмечается смягчение или исчезновение симптомов аллергии после отмены препарата.
предположения по группе аллергена:
– связь с простудными заболеваниями у больных с инфекционно-аллергической бронхиальной астмой, аллергическим ринитом;
– наличие сезонности;
Так, при поллинозах связь обострения заболевания с периодом цветения растений обычно настолько очевидна, что проведение аллергологического обследования становится необходимым лишь с целью уточнения спектра аллергенов для проведения специфической десенсибилизации.
Атопический дерматит, обусловленный гиперчувствительностью к аллергенам домашней пыли и плесневых грибов, обостряется ранней весной еще до цветения растений и поздней осенью (больше времени проводится в помещении).
– наличие наследственной предрасположенности при медиаторном типе ГНТ;
5) дифференциации пищевой аллергии с парааллергией (употреблением большого количества продуктов, содержащих биологически активные амины, что имитирует патофизиологическую стадию медиаторного типа ГНТ) и идиосинкразией (непереносимостью отдельных продуктов, например, молочных, обусловленной ферментопатией).
В диагностике пищевой аллергии существенное значение имеют сведения, четко указывающие на связь обострения с приемом конкретного пищевого продукта. При этом учитывается только обострение, которое развивается во временном диапазоне от нескольких минут до 4 часов с момета употребления в пищу подозреваемого продукта.
Существенное значение для выявления пищевых аллергенов имеет установление непереносимости продуктов, сходных по антигенной структуре с подозреваемым аллергеном. Например, пациенты, имеющие аллергию на куриное яйцо, чаще всего не переносят и мясо курицы. При непереносимости коровьего молока нередко отмечается аллергия на говядину.
II этап АЛМИ. Постановка кожно-аллергических проб предполагает введение предполагаемого аллергена в организм больного.
А. Антигены многих возбудителей обладают сенсибилизирующим действием, что используют для диагностики инфекционных заболеваний, а также при проведении эпидемиологических исследований.
Кожно-аллергические реакции при инфекционных заболеваниях появляются относительно рано (с 4–5 дня болезни), достигают наибольшей интенсивности на 2–3 неделе болезни. В зависимости от выраженности или напряженности аллергического процесса положительная реакция может сохраняться годами (напр., при бруцеллёзе) или исчезать довольно быстро, в течение нескольких недель-месяцев (напр., при дизентерии). Кожные пробы нашли применение в диагностике таких заболеваний как сап, мелиоидоз, бруцеллёз. Наиболее известна проба Манту, используемая как для диагностики туберкулёза, так и для оценки невосприимчивости организма к возбудителю (рис. 50, 51).
Кожно-аллергические пробы для диагностики ГЗТ предполагают внутрикожное введение Аг (аллергена). Аллергенные препараты готовятся специальными учреждениями – институтами вакцин и сывороток. Предполагаемый аллерген вводят внутрикожно в объёме 0,1 мл. Результат учитывают через 24–72 часа после введения аллергена по диаметру папулы (инфильтрата).
Рис. 50. Постановка пробы Манту
Рис. 51. Учет пробы Манту
Б. Кожные тесты используются при диагностике ГНТ медиаторного типа. Введенные в практику в 1911 году, кожные тесты остаются одним из самых достоверных диагностических тестов in vivo. Именно кожные тесты являлись и являются ориентиром для определения достоверности всех тестов in vitro. Кожное тестирование – ценный метод диагностики сенсибилизации, который широко используется во всех странах мира.
Для кожных тестов используют растворы аллергенов: трав, пыльцы, эпидермиса животных, яда насекомых, пищи, лекарств. Степень диагностической чувствительности кожных проб увеличивается в следующем порядке: капельная, аппликационная (накожная), укол (прик-тест), скарификационная (через царапину), внутрикожная.
Капельные пробы – аллерген наносится на неповреждённую кожу в виде капли.
Аппликационные пробы – раствором аллергена смачивают марлевый тампон и накладывают его на неповрежденный участок кожи (внутренней поверхности предплечья или спины). Затем этот участок заклеивается перфорированным лейкопластырем (рис. 52).
Рис. 52. Аппликационные пробы на коже спины
Оценка результатов проводится как в течение первого часа после нанесения на кожу аллергена (ГНТ), так и спустя 24–48 часов (ГЗТ). Оцениваются гиперемия кожи, зуд, отечность, мокнутие в месте нанесения вещества. Аппликационные тесты незаменимы для оценки индивидуальной переносимости различных наружных средств для лечения и ухода за кожей.
Скарификационные пробы – на чистую кожу предплечья наносят капли аллергенов, через них одноразовым скарификатором делают небольшие царапины (рис. 53).
Рис. 53. Постановка скарификационных проб
Прик-тесты – на чистую кожу предплечья наносят капли аллергенов, через них одноразовыми иглами делают легкие уколы (на один миллиметр в глубину).
Внутрикожные тесты – разведенный 1:100 (по отношению к кожным тестам) аллерген вводят внутрикожно в кожу предплечья в объёме 0,1 мл. Внутрикожные тесты ставятся с ингаляционными аллергенами в сложных диагностических ситуациях, когда клинические данные убедительно свидетельствуют о наличии сенсибилизации, а результаты кожных тестов сомнительны. Внутрикожные тесты с пищевыми аллергенами проводить категорически запрещено из-за их чрезмерной чувствительности и возможности провокации анафилактической реакции.
Противопоказания к кожному тестированию:
– обострение текущего аллергического заболевания;
– острое инфекционное заболевание (ОРВИ, ангина и др.);
– хроническое заболевание в стадии декомпенсации;
– беременность;
– туберкулезный процесс любой локализации в период обострения;
– психическое заболевание в период обострения;
– коллагенозы;
– злокачественные заболевания;
– длительная терапия кортикостероидами или местное их применение в области кожи, где предполагается проведение проб (отказаться за 2 недели до проведения проб);
– прием антигистаминных препаратов (отказаться за сутки до проведения проб);
– возраст старше 60 лет.
В таких ситуациях кожное тестирование запрещается или откладывается.
Кожное тестирование проводить нецелесообразно при:
– указании в анамнезе на острую реакцию к определенному аллергену (для исключения возможных анафилактических реакций);
– отсутствии подозрений на аллергическую природу заболевания;
– отказе родителей больного ребенка или самого больного от проведения тестирования;
– наличии у больного выраженного дермографизма;
– наличии у пациента инфекционных заболеваниях кожи или поражения кожи (отсутствии непораженных участков для проведения тестирования).
В этаких ситуациях кожное тестирование откладывают или используют лабораторные методы диагностики.
Аллергологические пробы проводятся в процедурном кабинете аллергологического отделения под контролем врача-аллерголога.
За один раз проводится не более 15 проб с различными аллергенами и 2 контроля. Положительный контроль содержит гистамин и указывает на то, что соблюдены все условия постановки теста. Отрицательный контроль содержит жидкость, которая не должна вызывать каких-либо кожных реакций (напр., изотонический раствор хлорида натрия). Результаты постановки кожных проб оцениваются относительно контролей. Если пациент перед проведением кожной пробы принимал антигистаминные препараты, то положительный контроль и пробы на аллергены не дадут реакции.
Положительный результат ГНТ регистрируется, если через 20 минут после контакта с аллергеном:
– наблюдаются везикула (волдырь) или эритема;
– наблюдается только эритема диаметром больше 20 мм;
– имеются признаки общей реакции (головокружение, тошнота).
При этом степень кожной реакции на аллерген оценивают по шкале от одного (+) до четырех (++++) плюсов:
+ – везикула или эритема до 3 мм;
++ – везикула или эритема до 6 мм;
+++ – везикула или эритема до 10 мм;
++++ – везикула или эритема более 10 мм.
Положительный контроль должен показать реакцию на ++ или +++, а отрицательный контроль – ничего не показать.
Рис. 54. Результаты кожных проб
Положительные результаты кожного тестирования свидетельствуют только о наличии сенсибилизации к аллергену и не являются доказательством его причинной значимости в возникновении заболевания. Аллерген, кожная проба на который положительна, можно считать причиной заболевания, только в том случае, если это совпадает с клиническими проявлениями и данными анамнеза. В то же время своевременное выявление сенсибилизации к аллергенам играет решающую роль при назначении профилактических мероприятий.
Если подозревалась аллергия на конкретный аллерген, а результат кожной пробы отрицателен, это не исключает аллергию на этот аллерген. Проба может быть повторена с другими сериями того же аллергена, так как разные серии аллергенов в зависимости от стандартизации аллергенов и индивидуальной чувствительности могут действовать по-разному. Кроме того, следует учитывать, что чувствительность кожи и слизистых оболочек (конъюнктивы глаз, слизистой носа) отличаются от друга. Поэтому при несовпадении результатов или сомнении ставят элиминационно-провокационные пробы.
Необходимость в проведении элиминационно-провокационных тестов чаще всего возникает у больных с атопическим дерматитом, так как у них наблюдаются положительные кожные пробы к множеству пищевых аллергенов, в то время как клинически значимыми обычно оказываются 1–3 пищевых продукта. Если в таких ситуациях, основываясь только на результатах кожных тестов, без проведения элиминационно-провокационного тестирования, исключить из питания множество продуктов, это будет неоправданным.
III э тап АЛМИ. Постановка провокационных проб предполагает воспроизведение симптомов аллергической реакции через принудительный контакт с аллергеном в период ремиссии.
Провокационные пробы применяют по строгим показаниям, когда имеются расхождения между данными анамнеза, результатами кожных проб и данными лабораторного обследования. При наличии аллергии на конкретный препарат, ставить провокационные тесты не рекомендуется. Провокационные пробы проводят в специализированных центрах, так как шоковая реакция возможна даже на микрограммы препарата.
Для провокационных проб могут быть использованы пероральный (пищевой), конъюнктивальный, назальный, ингаляционный или холодовой тесты. Если в ответ на введение предполагаемого аллергена развивается аллергическая реакция, то аллерген может считаться причинно значимым.
IV этап АЛМИ. Постановка элиминационных тестов. Элиминационные тесты используют для подтверждения причинного аллергена, если с ним имеет место постоянный контакт (напр., при пищевой аллергии). Элиминационная диета, исключающая определённые продукты, обладающие сесибилизирующим действием на организм пациента, назначается на 1-2 недели. При улучшении состояния пациента проводится провокационная проба, подтверждающая причинный аллерген.
V этап АЛМИ. Лабораторные методы выявления эффекторных молекул Ат и биологически активных аминов, а также сенсибилизированных лимфоцитов к аллергенам, опосредующих клинические проявления аллергических реакций. Лабораторные методы диагностики аллергии используются при наличии противопоказаний к кожным тестам. Лабораторные методы диагностики аллергии подробно изучаются в курсе иммунологии.
После аллергологического обследования пациента врач заполняет паспорт больного аллергией – медицинский документ, содержащий все сведения об аллергическом заболевании, которым страдает данный человек. Паспорт (или его копию) страдающий аллергией должен всегда иметь с собой и предъявлять при обращении за медицинской помощью.
Оценка АЛМИ.
Достоинства АЛМИ:
ранний метод диагностики ГНТ. При постановке кожно-аллергических проб можно выявить сенсибилизацию к определённому аллергену (напр., домашней пыли, стрептококкам) даже без признаков реализации в аллергическую реакцию. Кожно-аллергические пробы используются также для определения состояния сенсибилизации к антибиотикам и гетерологичным сывороткам.
быстрота получения результатов при постановке кожно-аллергических проб для диагностики ГНТ.
лабораторные методы диагностики ГНТ in vitro предпочтительны по безопасности и возможности использования в любой период заболевания. Они имеют основное значение в случаях, когда нельзя применять кожно-аллергические пробы и провокационные тесты.
выявление причинного аллергена позволяет проводить патогенетически обоснованную десенсибилизирующую терапию; этот подход наиболее успешно в настоящее время используется при поллинозах (пыльцевой аллергии).
Капельная проба.
Для постановки кожных капельных проб применяются водные растворы веществ. Обычно употребляются невысокие концентрации аллергенов, например, 0,25% раствор новокаина, 50000 пенициллина. Каплю раствора аллергена наносят на неповрежденную кожу (волярную поверхность) предплечья, живота. Параллельно ставят контрольную капельную пробу с растворителем (физиологическим раствором или дистиллированной водой).
Результаты капельной пробы регистрируются через 20 минут и спустя сутки с момента нанесения испытуемого раствора лекарственного вещества. Если в месте нанесения лекарства есть гиперемия, отек, то реакция положительная, данный препарат назначать нельзя.
Аппликационная кожная проба.
Аппликационные кожные пробы делают на волярной поверхности предплечья, на животе, спине. При этом на кожу накладывают марлю размером 2х2 см, смоченную раствором исследуемого лекарственного вещества. Сверху марли накладывают компрессную бумагу или целлофан, затем наклеивают кусок лейкопластыря 4х4 см. Аналогичным образом делают и с контрольным растворителем (физ.раствором).
Результаты оцениваются через 24-72 часа следующим образом: гиперемия (+); гиперемия, отечность, образование папул (++); яркая эритема, отечность, папулы, везикулы (+++); образование крупных пузырей и некроза (++++). Лейкопластырь в местах непосредственного контакта с кожей, как правило, вызывает раздражение кожи (непосредственная реакция-гиперемия, отек), поэтому оценивать нужно только участок кожи, непосредственно соприкасающийся с марлей, смоченной раствором лекарственного препарата.
В случае резкого нарастания аллергической реакции (появление зуда, чувства жжения и т.д.) пробу следует быстро снять и обмыть кожные покровы, и данное лекарство не назначать.
Скарификационная кожная проба.
Перед постановкой этой пробы - кожу (спины, живота или внутренней поверхности предплечья) следует обработать спиртом. Затем на расстоянии 5 см друг от друга наносят каплю 0,01% раствора гистамина (положительный контроль), каплю испытуемого лекарственного аллергена и каплю разводящей жидкости - физиологического раствора (отрицательный контроль). Стерильными иглами или скарификаторами наносят две поверхностные скарификации (не кровоточащие) в длину до 5-10 мм, на расстоянии 3 мм друг от друга. Реакцию оценивают через 20 минут, промокая капли аллергена отдельными ватными тампонами. Надо смотреть и через 24 часа (могут быть замедленные реакции).
Если на месте скарификации развивается гиперемия, а при натягивании кожи отек (побеление) в месте царапин, реакция слабоположительная (+).
Если волдырь с гиперемией в месте царапин виден на глаз, а при натягивании отек увеличивается, то реакция положительная (++).
Волдырь диаметром 10 мм с гиперемией и ложноножками свидетельствует о резко положительной реакции (+++).
Волдырь размером более 10 мм в диаметре с псевдоподиями и гиперемией показывает о реакции положительной в очень резкой степени (++++).
Провокационная подъязычная проба.
Перед проведением пробы осмотреть подъязычную область. Больному под язык дается 1/4 разовой терапевтической дозы испытуемого лекарственного препарата. При положительной пробе через 10-20 минут у больного появляется отек уздечки языка, отек губ, кожный зуд; единичные или распространенные уртикарные высыпания. При этом больной должен немедленно удалить оставшуюся часть препарата, прополоскать рот, не глотая жидкости, и принять антигистаминные.
Провокационная проба.
Пероральная:
Больному дается 1/4 разовой терапевтической дозы испытуемого лекарственного препарата. При положительной пробе в течение ближайших 2 часов могут появиться удушье, единичные волдырные элементы, повышение температуры. При этом больному дается солевое слабительное и назначаются антигистаминные препараты.
Парентеральная:
Четверть разовой дозы вводится внутримышечно в область бедра, если препарат вводится внутримышечно; п/к - в область предплечья, если препарат вводится подкожно и оценивается через 20 минут. При отрицательном результате через два часа вводится разовая доза. При проведении пробы с препаратом для внутривенного введения готовится раствор для внутривенного капельного введения и вводится медленно 10-20 капель в минуту в течении 2-5 минут. При отсутствии общих клинических симптомов и изменений гемодинамики введение лекарственного вещества продолжается.
Провокационные пробы проводятся врачом под контролем гемодинамики.
Тест торможения естественной эмиграции лейкоцитов in vivo для специфической диагностики лекарственной аллергии (ТТЭЛ)
Для ТТЭЛ необходимы:
Оборудование: (на одно исследование)
1. 4 химических стаканчика емкостью 50 мл.
2. 5 пробирок емкостью 20 мл.
3. Штатив для пробирок (1).
4. 2 пипетки (1,0 и 10,0 мл.).
5. Микропипетки (2).
6. Счетная камера Горяева (1).
7. Часовое стекло (1).
8. Микроскоп бинокулярный (об.20, ок.7)
Реактивы:
1. Физиологический раствор рН 7,3-7,4 (рН раствора устанавливается добавлением 0,1 М NаОН при помощи потенциометра ПП-0,1).
2. 0,01% раствор красителя генцианового фиолетового в 3% уксусной кислоте.
Медикаменты:
Для исследования используются водорастворимые формы медикаментов в следующих концентрациях:
1. Пенициллин - 1 мк/мл.
2. Цефалоспорины (цефазолин, кофзол, цефамизин)-1 мкг/мл.
3. Аминогликозиды (стрептомицин, канамицин, гентамицин)-10 мкг/мл.
4. Макролиды (эритромицин)-10 мкг/мл.
5. Хлорамфеникол (левомицетин) -10 мкг/мл.
6. Тетрациклины -10мкг/мл.
7. Сульфаниламидные препараты-100 мкг/мл.
8. Производные пиразолона и ацетилсалициловой кислоты-100 мкг/мл.
9. Местные анестетики (новокаин, лидокаин, тримекаин)-100 мкг/мл.
10. Антибиотики других химических групп - 10 мкг/мл.
Если у больного в анамнезе отмечались анафилактические реакции на введение медикаментов, то независимо от названия лекарственного препарата исследования начинают с концентрации препарата 1 мкг/мл. В случае отрицательного результата тест повторяют с этим же медикаментом в дозе 10 мкг/мл, а если необходимо - то с дозой 100 мкг/мл.
В один день можно проводить только одно исследование с одним препаратом и с одной его концентрацией. Во время проведения теста запрещается принимать пищу, пить, курить, принимать лекарственные препараты. Тест проводится в процедурном кабинете.
До и после постановки ТТЭЛ in vivo врач тщательно осматривает больного, измеряет АД, ЧСС, частоту дыхания.
Обследование рассчитано на 1,5 часа и состоит из двух этапов.
Подготовка материала к исследованию:
1. Через час после еды больной тщательно прополаскивает полость рта кипяченой водой для механической очистки ее в течении 2-х минут.
2. Спустя 30 минут после первого полоскания следует прополоскать передний отрезок полости рта 10 мл физиологического раствора (рН 7,3-7,4) в течение 2-х минут.
3. Жидкость из полости рта (промывные воды) собирают в стаканчик №1, как исходную порцию (контроль).
4. Через 15 минут производится полоскание полости рта в течение 2-х минут физиологическим раствором с разведенной в нем исходной концентрацией испытуемого медикамента. Эта порция промывной жидкости собирается в стаканчик №2 и в дальнейшей работе не используется.
5. Еще через 15 минут вновь ополаскивают передний отрезок полости рта в течение 2-х минут 10 мл физиологического раствора (рН 7,3-7,4) и промывную жидкость собирают в стаканчик №3.
6. После этого через 15 минут передний отрезок полости рта ополаскивают в течение 2-х минут 10 мл физиологического раствора (рН 7,3-7,4) и собирают промывную жидкость в стаканчик №4.
II-й этап:
Окраска и подсчет лейкоцитов в собранном материале. Приготовление и просмотр окрашенных мазков.
1. Промывную жидкость из полости рта в стаканчике №1 (контрольная порция) после получения тотчас тщательно перемешивают микропипеткой и в количестве 0,2 мл помещают на часовое стекло.
2. Туда же добавляют 0,04 мл раствора красителя генцианового фиолетового.
3. Через 5 минут исследуемую смесь помещают под притертое стекло камеры Горяева.
4. Подсчет лейкоцитов проводиться в 100 больших квадратах камеры Горяева и рассчитывает количество лейкоцитов в 1 кубическом мм.
Таким же образом подсчитывают количество лейкоцитов в стаканчиках № 3 и 4 (опытные порции)
Индекс эмиграции лейкоцитов в полости рта рассчитывают по формуле:
|
|
где Нк-количество лейкоцитов (нейтрофилов) в первой, исходной порции, Но-количество лейкоцитов (нейтрофилов) в опытных стаканчиках №3 и 4.
Тест оценивается как положительный при снижении числа клеток по индексу эмиграции более, чем на 30%.
Приложение №5 .
7039 0
Эти методы могут широко использоваться при аллергических заболеваниях в фазе обострения, в периоды массивного контакта с аллергеном, при высокой чувствительности заболевших к аллергену, при наличии противопоказаний, у детей, при идентификации профессиональных аллергических заболеваний, так как исключают возможность появления неспецифических, ложноаллергических реакций.
Среди различных способов специфической аллергодиагностики при реагиновом IgE-зависимом типе более предпочтительно определение моноклональных IgE.
Существуют непрямые методы определения IgE и наиболее распространенные прямые методы выявления специфических IgE, основанные на новых технологиях и использовании диагностикумов в виде стандартизованных и сертифицированных аллергенов к ним.
Реакция пассивного переноса по Праустнитцу—Кюстнеру (непрямой метод постановки кожной пробы) чаще используется в детской практике при идентификации пищевой аллергии. Сущность метода заключается в реакции пассивного переноса реципиенту сенсибилизации с помощью внутрикожного введения 0,1 мл сыворотки крови больного с наличием в ней предполагаемых специфических IgE. Спустя 24 ч в этот же участок вводят 0,02 мл предполагаемого аллергена. Реакцию регистрируют через 20 мин. Однако угроза переноса СПИДа, вирусного гепатита и других инфекций не позволяет широко использовать данный метод.
Определение специфических IgE
Исследование общего IgE осуществляется с помощью бумажного радиоиммуносорбент-ного теста (метод PRIST), определение аллергоспецифического IgE — радиоаллергосорбентного теста (метод RAST). Наряду с ними в настоящее время для определения аллергоспецифичес-ких IgE все шире используется способ иммуноферментного анализа (ИФА).Метод RAST наиболее специфичен и точен, так как основан на использовании радиоактивной метки. Сущность его заключается в связи специфического IgE исследуемой сыворотки с аллергеном, размешенным на бумажной пластинке. После отмывания неспецифического (общего) IgE в содержимое добавляются меченые 125I антитела против IgE. Образовавшийся радиоактивный комплекс считывается на сцинтилляционном счетчике.
Метод ИФА
Сыворотка обследуемого, содержащая специфические IgE, наслаивается на полистирольную поверхность микропланшет с адсорбированным набором аллергенов, с которыми связываются только определенные специфические IgE.При точечном иммуноанализе аллергены наносятся в виде точек на нитроцеллюлозные диски.
Для определения концентрации специфических IgE, связанных с аллергеном, добавляются антиантитела (меченные ферментом) к IgE. На следующем этапе с помощью специальных реагентов, воспроизводящих цветную реакцию, интенсивность которой зависит от концентрации специфических lgЕ в комплексе с аллергеном, определяют содержание специфических lgЕ фотометрически в вертикальном луче в системе «Унискан» или «Мультискан». В норме она не превышает 210 МЕ/ед.
Наряду с выявлением специфических lgЕ используются и другие лабораторные тесты для диагностики как антителозависимых реакций (определение показателей специфического повреждения базофилов, аллергических антител в реакции пассивной гемагглютинации, реакция связывания комплемента и др.), так и реакций замедленного (клеточного) типа (реакция торможения миграции лейкоцитов крови — РТМЛ, тест розеткообразующих клеток — РОК, тест повреждения нейтрофилов и др.).
Их применение в аллергологической практике не потеряло своего значения — идентификация повышенной чувствительности к аллергенам, аутоантигенам позволяет осуществлять более целенаправленное лечение и реабилитацию больных.
Реакция прямого специфического повреждения базофилов крови
Базофилы крови, тучные клетки — клетки-мишени в реализации аллергических реакций немедленного типа. lgЕ с помощью Fс-фрагмента фиксируются на рецепторах мембран этих клеток, а с помощью Fаb-фрагмента специфически реагируют с аллергеном. Это сопровождается резкой активацией (дегрануляцией) клеток-мишеней, что и используется в качестве маркера аллергической реакции.Для постановки реакции 5 мл исследуемой крови добавляют в центрифужную пробирку с 5 каплями 6 % водного раствора трилона Б и инкубируют в течение часа при 37 °С. Образовавшуюся взвесь лейкоцитов с помощью пастеровской пипетки переносят в чистую пробирку, а затем разливают в две центрифужные пробирки по 0,3 мл. В первую пробирку (опытную) добавляют 0,1 мл изотонического раствора хлорида натрия, в котором растворена рабочая доза аллергена, во вторую (контрольную) — 0,1 мл изотонического раствора хлорида натрия без аллергена.
Обе пробирки инкубируют в течение 10 мин при 37 °С, затем центрифугируют в течение 10 мин при 1500 об/мин. После чего сливают надосадочную жидкость, а лейкоцитарную массу, оставшуюся на дне пробирки, осторожно встряхивая, разбивают в остатке жидкости, стекающей со стенок. С помощью пастеровской пипетки содержимое каждой пробирки переносят на отдельные предметные стекла (в виде капли на край) и шлифованным краем другого стекла готовят тонкие лейкоцитарные мазки.
Мазки окрашивают эозин-метиленовым синим по Май—Грюнвальду в течение 1—2 мин после просушивания на воздухе. После промывания препарата в метиловом спирте мазки-препараты микроскопируют с иммерсией (увеличение 10 х 80). Просчитывают 50 базофилов по краям мазка и число поврежденных средних клеток. Показатель поврежденных клеток в опытном и контрольных препаратах определяют по формуле:
Реакция считается положительной при показателе 1,4 и выше.
Л.А. Дуева с соавт. (1986) подобрали рабочие концентрации и дозы химических аллергенов и антибиотиков для реакции прямого специфического повреждения базофилов крови (табл. 4).
Таблца 4. Рабочие концентрации и дозы реагентов для РСПБ
Тест деструкции тучных клеток
Для получения взвеси тучных клеток вводят внутрибрюшинно крысе 8—10 мл (мыши — 2—5 мл) подогретого до 37 °С изотонического раствора хлористого натрия, приготовленного на 0,15 моль фосфатном буфере с рН 7,2, слегка массируют живот. Суспензию тучных клеток отмывают изотоническим раствором хлористого натрия, затем центрифугируют при 500 об/мин.Суспензию тучных клеток (0,02 мл) и сыворотку больного (0,02 мл) инкубируют 15 мин при 37 °С, затем вносят 0,02 мл аллергена в предварительно подобранной концентрации и снова инкубируют 15 мин при 37 °С. Одномоментно готовят три контроля: тучные клетки без сыворотки и без аллергена; тучные клетки с сывороткой без аллергена; тучные клетки с аллергеном без сыворотки.
После окраски образцов 0,025 % раствором толуидинового синего или 0,3 % раствором нейтральной краски заполняют суспензией тучных клеток камеры Горяева и подсчитывают окрашенные клетки, сравнивая число гранулированных клеток в контроле и опыте. Наблюдаемая дегрануляция тучных клеток в испытуемом образце считается слабоположительной при наличии 10—20 % дегрануляции, положительной — при 21—40 %, резкоположительной — при дегрануляции более 40 % клеток по сравнению с контролем.
Концентрация аллергенов, не вызывающая спонтанной дегрануляции, для антибиотиков — 100—1000 ЕД/мл, калия бихромата и йодида, натрия хромата, никеля сульфата — 0,01—0,1 % раствора, формальдегида — 0,2—0,4 %. Бытовые аллергены используются в дозе от 10 до 100 PNU.
Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) позволяет обнаруживать антитела к водорастворимым и водонерастворимым аллергенам.
Реакция основана на феномене агглютинации эритроцитов, сенсибилизированных in vitro к химическим аллергенам, при добавлении сыворотки пациента, содержащей антигаптенные антитела.
Реакция торможения миграции лейкоцитов крови (РТМЛ) основана на способности сенсибилизированных Т-лимфоцитов (например, к гаптенам) выделять лимфокин — фактор, ингибирующий миграцию лейкоцитов. С помощью РТМЛ раскрывается реакция клеточного типа (неантителозависимая) к различным антигенам.