18.01.2009, 17:36
Здравствуйте!
Прошу порекомендовать разрешение следующей ситуации. У меня проблемы с лечением зубов были всегда, не так давно мне нужно было удалить несколько зубов. Для обезболивания был использован септонест. После его введения поднялось давление до 190 и началась тахикардия 150 уд/мин. (мое давление 110) После укола тавегила, давление стало нормализовываться. На следующий день наблюдалась осиплость голоса. Врач считает, что мне противопоказаны анестетики: убестезин, ультракаин, септонест.
Поскольку зубы лечить все равно надо, как мне поступить?
19.01.2009, 00:06
До этого случая вы уже лечили зубы с анестезией? Прошлые введения анестетика тоже сопровождались такой реакцией или это впервые? Также интересует какая именно делалась анестезия и концентрация адреналина в использованном анестетике и наличие заболеваний сердечно-сосудистой системы
Подобная реакция может быть связана с попаданием анестетика в кровеносный сосуд (при некоторых видах анестезии существует вероятность попасть в кровеносный сосуд). Также такие симптомы могут быть реакцией на адреналин, входящий в состав анестетика.
У нас пациентов с непереносимостью местных анестетиков направляют в отделение хиургической стоматологии стационара, где обследуют и лечат под местной анестезией или под наркозом.
19.01.2009, 09:51
Спасибо за быстрый ответ! До этого во время небольших вмешательств применялся лидокаин, недавно удаляла родинку на лице с его применением. Перенесла хорошо, но и дозировка, видимо, была небольшая.
Септонест применялся два раза, второй я вам описала, а первый тоже в стоматологии, после чего было повышенным давление до 140 и в течение 5-6 часов не могла остановить кровотечение из зуба.
Из сердечно-сосудистых заболеваний есть экстрасистолическая аритмия.
Врач мне написала противопоказания: р-р убестезин 4 у, р-р ультракаин 2 у, р-р септонест. По концентрации адреналина, к сожалению, ответить не могу.
18.02.2009, 18:33
Здравствуйте,
сделала иммунологический анализ на анестетики и вот такие результаты получились:
1. Ультракаин Д-С - 81 (11%)
2. Ультракаин Д-С форте - 61 (32%)
3. Анреналин - 64 (29%)
4. Лидокаин - 58 (36%)
5. Скандонест - 76 (16%)
6. Убестезин форте - 58 (36%)
7. Септанест с андреналином - 65 (28%)
По степени активности:
Получается, что эти препараты применять нельзя (все >10%) при анестезии в стоматологии. И что теперь можно предпринять?
18.02.2009, 21:12
Я Вам намекну в отношении ценности проведенного анализа:
"Реакция специфического лейкоцитолиза показала изменение количество лейкоцитов по отношению к контролю 91 (100%) с препаратами:
...
4. Лидокаин - 58 (36%)
...
лизис до 11% - слабоположительный
лизис до 21%-40% - умеренноположительный
лизис до 41%-100% - резкоположительный
До этого во время небольших вмешательств применялся лидокаин, недавно удаляла родинку на лице с его применением. Перенесла хорошо
Дубовой Б.Л., Полякова О.Н. ГНУ СКЗНИВИ, г. Новочеркасск
Туберкулез причиняет огромный экономический ущерб и представляет большую опасность для здоровья людей. Пер-востепенной задачей в противотуберкулезных мероприяти-ях является своевременная диагностика, ранее выявление источника возбудителя инфекции.
Прижизненная диагностика аллергическими исследованиями запоздалая и не выявляет животных в первые дни, и даже месяцы после их заражения. Поэтому, требуются более чувствительные мето-ды, которые позволяют выявить этиологию аллергического процесса при туберкулезе.
Для дифференциации неспецифических туберкулиновых реак-ций используют симультанную пробу с аллергенами - ППД для млеко-питающих и КАМ, изготовленных из нескольких штаммов атипичных микобактерий. Симультанную аллергическую пробу применя-ют при первичной постановке диагноза на туберкулин в благополуч-ных хозяйствах и в случае, если реакции на туберкулин обусловлены атипичными микобактериями и кислотоустойчивыми сапрофитами. Также прибегают к комиссионному контрольно-диагностическому убою животных с реакцией на внутрикожное введение туберкулина, для уточнения диагноза патологоанатомическими, бактериологичес-кими исследованиями и биопробой.
Однако владельцы высокоудойных коров оспаривают право-мерность контрольно-диагностического убоя животных, давших по-ложительную реакцию на туберкулиновую пробу, и требуют прижиз-ненных способов диагностики для дополнительного исследования высокопродуктивных животных на туберкулез. Поэтому кроме симультанной аллергической пробы, патологоанатомических осмотров и лабораторных исследований, эпизоотологического обследования хозяйств, анализа динамики проявления аллергических реакций у различных групп животных, для изучения неспецифических туберку-линовых реакций у крупного рогатого скота и дифференциации их от специфических используют клеточные реакции ин витро - реакцию бласттрансформации лимфоцитов и специфического лизиса лейкоци-тов и другие реакции.
В нашем исследовании для выявления причин неспецифичес-ких туберкулиновых реакций использовали реакцию специфического лизиса лейкоцитов в сопоставлении с патологоанатомическими изме-нениями.
Постановку РСЛЛ выполняли в модификации Б.Л. Дубового.
Целью исследований явилось выявление причин неспецифичес-ких реакций, связанных с дифференциальной диагностикой туберку-леза, вызванного разными видами микобактерий, что имеет большое ветеринарно-санитарное, эпизоотическое и хозяйственное значение.
Выявление инфицированных микобактериями и больных ту-беркулезом животных реакцией специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ) in vitro основана на явлении немедленно появляющейся повы-шенной чувствительности лейкоцитов к повторному контакту с антиге-ном (аллергеном) вне организма .
В производственных условиях испытания РСЛЛ для возможной диагностики туберкулеза выполняли в базовых хозяйствах Ростовской области. Так на ранее благополучной ферме восемь коров реагирова-ли на туберкулин. Их подвергли контрольно-диагностическому убою. При ветеринарно-санитарной экспертизе патологоанатомических из-менений во внутренних органах и лимфатических узлах визуально не обнаружили. Бактериологические исследования патматериала в Рос-товской областной лаборатории были отрицательными.
Перед убоем у коров взяли кровь для проведения реакции спе-цифического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ). Результаты исследований по количеству лейкоцитов и показателям РСЛЛ в пробах крови представ-лены в таблице.
Таблица. Количество лейкоцитов, показатели РОЛЛ и патологоанатомические изменения у прореагировавших на туберкулин коров.
Как видно из таблицы, во всех пробах крови с ППД-туберкулином для млекопитающих реакция специфического лизиса лейкоцитов была отрицательной, что свидетельствует об отсутствии инфицирова-ния их M. bovis.
В пробах крови четырех убитых коров реакция специфического лизиса лейкоцитов была положительна с ППД-туберкулином для птиц. Лизис лейкоцитов в пробах был 11%, 20%, 22%, 26%, что указывает на инфицирование животных M. avium.
В пробах крови четырех животных получен положительный ре-зультат РСЛЛ с КАМ. Процент лизиса лейкоцитов составил 11%, 13%, 15%, 20%, что связано с инфицированием животных при жизни ати-пичными микобактериями.
Таким образом, выполненные исследования крови с туберкулинами вне организма от животных с положительными туберкулиновы-ми пробами позволяют в короткие сроки выявить истинные причины, вызвавшие сенсибилизацию организма к туберкулину, и, главное, делают возможным исключить необоснованный убой высокопродук-тивных животных. Возможность применения способа диагностики in vitro неспецифически туберкулиновых реакций непосредственно в условиях хозяйств будет способствовать широкому применению ал-лергенов различной природы в качестве средств дифференциальной диагностики специфических и неспецифических туберкулиновых ре-акций.
Предлагаемый способ диагностики неспецифических туберкули-новых реакций рекомендуем использовать в бла-гополучных по туберкулезу хозяйствах. Для этого от всех животных, давших положительную реакцию на внутрикожное введение туберкулина, берут кровь и исследуют ее вне организма с имеющимися туберкулинами, что позволяет выявить этиологию туберкулиновых реакций, вызванных микобактериями различных видов.
Список литературы
- Верховский, О.А. Диагностическое значе-ние реакций клеточного иммунитета при туберкуле-зе крупного рогатого скота / О.А. Верховский, А.Х. Найманов, О.А. Савицкая // Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии живот-ных. Материалы международной научно-практи-ческой конференции Москва, 16-17 мая, 2006. - М.; ИзографЪ, 2006. - С.180-186.
- Дубовой, Б.Л. Новое в дифференциальной диагностике туберкулеза сельскохозяйственных животных / Б.Л. Дубовой, О.Н. Соловьева, Н.В. Улько // Сборник научных трудов "Диагностика, про-филактика и лечение при инфекционных болезнях сельскохозяйственных животных".- Персиановский, 2000. - С.8-12.
- Дубовой, Б.Л. Исследования специфичности и активности РСЛЛ при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота / Б.Л. Ду-бовой, О.Н. Полякова // Инновационный путь развития АПК-магист-ральное направление научных исследований для сельского хозяйства. - Персиановский, 2007. - С.67-69.
- Найманов, А.Х. Дифференциация аллергических реакций на туберкулин / А.Х. Найманов // Ветеринария. - 2002. - N°3.- С.10-12.
- Наставление по проведению симультанной пробы с примене-нием туберкулина комплексного аллергена из атипичных микобактерий (КАМ) при диагностике туберкулеза животных. Ветеринарное законодательство. Т. 3, М.: "Колос", 1981.- С.220-224
- Эпизоотологический контроль и постановка диагноза на тубер-кулез у животных разных видов. Профилактика и борьба с заразными болезнями, общими для человека и животных. Сборник санитарных и ветеринарных правил. Изд. Официальное. Госкомсанэпиднадзор Рос-сии. Минсельхозпром России. Москва, 1996.- С. 164 - 167.
Реферат
Требуются более чувствительные методы, которые позволяют выявить этиологию аллергического процесса при туберкулезе. Для определения этиологии неспецифических туберкулиновых реакций в благополучных хозяйствах использовали ППД-туберкулин для птиц и КАМ вне организма с кровью животных, реагирующих на тубер-кулин для млекопитающих. Показано, что РСЛЛ можно использовать для дифференциации специфических и неспецифических реакций на туберкулин.
Ключевые слова: диагностика, туберкулез, реакция специфи-ческого лизиса лейкоцитов (РСЛЛ).
UDC 619.616.002.5
DIAGNOSTICS OF UNSPECIFIC REACTIONS TO TUBERCULINE CAUSED BY ATYPICAL AND AVIAN MYCOBACTERIES Dubovoi B.L., Polyakova O.N. Summary
More sensitive methods that can detect the etiology of allergic process at tuberculosis are required. PPD-tuberculin for birds and CAM outside the body with the blood of animals, reacting to tuberculin for mammals, were used to determine the etiology of nonspecific tuberculin reactions in wealthy economies. It is founded the RSLL can be used for the differentiation both of specific and unspecific reactions to tuberculine.
Key words: diagnostics, tuberculosis, reaction of specific lysis of leucocytes (RSLL).
About the authors
Dubovoy Boris L. - D. Sc. in Veterinary Medicine, professsor, chief of infectious diseases of farming animals and poultry research laboratory of the State scientific establishment "North Caucasian zonal veterinary research institute" of Russian Academy of agricultural sciences; 6/4. Veterinarnaya st., Novocherkassk, Rostov region, 394400; Tel.89281360864.
Responsible for correspondence with the editorial board: Polyakova Olga N.- post-graduate student of the State scientific establishment "North Caucasian zonal veterinary research institute" of Russian Academy of agricultural sciences; 28, Sadovaya st., Novocherkassk, Rostov region, 394406; Tel.89287549422
Дубовой Борис Лаврентьевич, доктор ветеринарных наук, про-фессор, заведующий лабораторией по изучению инфекционных болезней сельскохозяйственных животных и птицы ГНУ "Северо-Кавказский зональный научно-исследовательский ветеринарный институт" Российской академии сельскохозяйственных наук; 394400, Ростовская область, г. Новочеркасск, ул. Ветеринарная, д.4, кв.6; тел.: 89281360864.
Ответственный за переписку с редакцией : Полякова Ольга Николаевна, аспирант ГНУ "Северо-Кавказский зональный науч-но-исследовательский ветеринарный институт" Российской ака-демии сельскохозяйственных наук; 394406, Ростовская область, г. Новочеркасск, ул. Садовая, д.28; тел.: 89287549422.
размер шрифта
ПРОФИЛАКТИКА И ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА ЛЮДЕЙ- МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ- МУ 3-1-7-1189-03 (утв- Главным государственным... Актуально в 2018 году
5.3.2. Реакция лизиса лейкоцитов
Введение специфического антигена в сенсибилизированный организм небезразлично для обследуемого. В этой связи заслуживает внимания эффективный метод выявления гиперчувствительности замедленного типа методом in vitro с помощью реакции лизиса лейкоцитов (РЛЛ). РЛЛ основана на учете разрушения лейкоцитов сенсибилизированного организма под влиянием специфического антигена, регистрируемого методом in vitro. РЛЛ обладает строгой специфичностью, дает возможность количественного учета степени сенсибилизации организма, позволяет получить ответ через 3 - 4 часа после взятия крови.
Техника постановки РЛЛ.
РЛЛ проводится в пробирках из химически чистого стекла. В качестве антигена используется взвесь убитых нагреванием бруцелл (может быть использован вакцинный штамм В.abortus 19BA) в
7 концентрации 1 x 10 мкл/мл.
Кровь для исследования берется в количестве 1 мл и вносится в колбочку с гепарином из расчета 75 - 80 ме гепарина на 1 мл крови. По 0,4 мл гепаринизированной крови помещается в 2 пробирки. В первую пробирку добавляют 0,1 мл бруцеллезного антигена (опытная пробирка), во вторую - 0,1 мл физраствора для установления неспецифического лизиса лейкоцитов (контрольная пробирка). Пробирки встряхивают в течение 2 - 3 мин., после чего проводят подсчет лейкоцитов в камере Горяева по принятому в гематологии методу. Затем пробирки помещают в термостат на 2 часа при 37 °C и периодически встряхивают их через 15 - 20 мин. После инкубации пробирки вновь встряхивают в течение 2 - 3 мин. и проводят подсчет лейкоцитов. Подсчет производится не менее 2 - 3 раз для каждой пробирки, а затем выводится среднее их количество. Наличие лейкоцитов после инкубации в опытной и контрольной пробирках подсчитывается по формуле: количество лейкоцитов после инкубации x 100% количество лейкоцитов до инкубации.
Показатель специфического лизиса лейкоцитов (ПСЛ) подсчитывается путем определения разницы - процент уменьшения лейкоцитов в опытной пробирке минус процент уменьшения лейкоцитов в контроле. ПСЛ выражается отрицательной величиной и колеблется в пределах от -10 до -30%. ПСЛ меньше -10% свидетельствует о неспецифическом лизисе.
ТРЕБОВАНИЯ
К ПОСТАНОВКЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ПО ОБОСНОВАНИЮ ПРЕДЕЛЬНО ДОПУСТИМЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ ПРОМЫШЛЕННЫХ ХИМИЧЕСКИХ АЛЛЕРГЕНОВ В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ И АТМОСФЕРЫ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУ 1.1.578-96
1. Разработаны НИИ медицины труда РАМН (Дуева Л.Л, Алексеева О.Г.), НИИ экология человека и гигиены окружающей среды РАМН (Пинигин М.А., Тепикина Л.А), Институтом иммунологии Минздравмедпрома России (Черноусов А.Д.), Центральным кожно-венерологическим институтом Минздравмедпрома России (Умеров Ж.Г.), Санкт-Петербургским НИИ гигиены труда и профзаболеваний Минздравмедпрома России (Сидорин Г.И., Мартинсон Т.Г.), Белорусским научно-исследовательским санитарно-гигиеническим институтом (Шевляков В.В.), Харьковским НИИ гигиены труда и профзаболеваний (Василенко Н.М.), Центральной научно-исследовательской лабораторией Латвийской медицинской Академии (Иванова И.А.).
2. Утверждены и введены в действие Первым заместителем Председателя Госкомсанэпиднадзора России - заместителем Главного государственного санитарного врача Российской Федерации С. В. Семеновым 21 октября 1996 г.
3. Введены взамен методических рекомендаций "Постановка исследований по гигиеническому нормированию промышленных аллергенов в воздухе рабочей зоны" (1980) и в дополнение к "Временным методическим указаниям по обоснованию предельно допустимых концентраций загрязняющих веществ в атмосферном воздухе населенных мест" (1989).
^ 1. Область применения
Методические указания предназначены для токсикологов, занимающихся обоснованием гигиенических нормативов вредных веществ в воздухе рабочей зоны и атмосферы. Методические указания посвящены установлению гигиенических нормативов промышленных химических аллергенов в воздухе рабочей зоны и атмосферы. Более чем десятилетняя практика обоснования гигиенических нормативов (ПДК и ОБУВ) промышленных аллергенов в воздушной среде подтвердила эффективность данного мероприятия по профилактике развития аллергических заболеваний у рабочих аллергоопасных производств и населения промышленных регионов. Настоящие методические указания разработаны с учетом накопленных за эти годы данных по теории и практике токсикологической аллергологии. При этом предусмотрен единый подход к обоснованию гигиенических нормативов промышленных химических аллергенов в воздухе рабочей зоны и атмосферы.
Оценка аллергоопасности при установлении гигиенических нормативов химических соединений и сложных продуктов на их основе обязательно проводится в следующих случаях:
При нормировании новых химических соединений, принадлежащих к химическим классам, неизученным в аллергологическом плане;
При нормировании химических соединений и сложных продуктов, принадлежащих к химическим классам, содержащим уже известные аллергены, или имеющих химические аналоги, обладающие сенсибилизирующим действием;
При наличии жалоб аллергического характера или клинических признаков аллергических поражений у людей, имеющих контакт с данным химическим соединением или продуктом.
^ 2. Схема постановки исследований
Исследования проводят в два этапа. Цель 1-го этапа - выявление аллергенных свойств изучаемого вещества, 2-го этапа - обоснование величины гигиенического норматива (см. схему).
На 1-м этапе исследований используют методы экспресс-сенсибилизации морских свинок и мышей.
^ Схема постановки исследований
I этап - выявление аллергенных свойств
II этап - обоснование величины санитарного стандарта
А. Нормирование по аналогии
^ Б. Нормирование по ускоренной и полной схеме
При изучении простых химических соединений рекомендуется применение метода сенсибилизации морских свинок внутрикожно в зону уха и/или воспроизведение гиперчувствительности замедленного типа (далее - ГЗТ) на мышах.
Сенсибилизация морских свинок, как наиболее чувствительного вида лабораторных животных к действию химических аллергенов, позволяет оценить аллергенную активность изучаемого вещества. С этой целью животных сенсибилизируют введением в зону уха двух доз вещества: 50 и 200 мкг/животное. Воспроизведение ГЗТ на мышах позволяет выявить аллергенные свойства не только растворимых, но также нерастворимых в воде твердых и пастообразных веществ, обладающих сильной или умеренной аллергенной активностью. Поскольку введение мышам слабых аллергенов не проявляется развитием четко выраженной ГЗТ, при отрицательном или сомнительном результате данного эксперимента на мышах следует дополнительно провести сенсибилизацию морских свинок в дозе 200 мкг/животное. При этом, а также для веществ с предполагаемой слабой аллергенной активностью не исключается использование еще более высокой сенсибилизирующей дозы - 500 мкг/животное. При изучении сложных по составу и неотвержденных полимерных продуктов осуществляют комбинированную сенсибилизацию морских свинок (в кожу уха и дополнительно эпикутанно) и/или применяют метод воспроизведения ГЗТ на мышах.
В дополнение к этим обязательным приемам исследований I-го этапа по соответствующим показаниям могут быть использованы также и другие способы сенсибилизации животных. Так, при исследовании химических соединений и продуктов, особенно пастообразных и вязких, загрязняющих кожные покровы рабочих, целесообразна проверка возможности развития контактной аллергии методом многократных эпикутанных аппликаций на морских свинках. Для водонерастворимых промышленных пылей уже на I-м этапе исследования может быть применен способ внутритрахеальной сенсибилизации белых крыс.
Если на I-м этапе исследования аллергенные свойства у изучаемого вещества не выявлены, то его нормируют как вещество общетоксического действия. Если хотя бы один из приемов сенсибилизации позволил выявить аллергенные свойства изучаемого вещества, то обязательно проводят II-й этап исследований.
II-й этап исследований, в зависимости от приема нормирования (по аналогии, ускоренной или полной схеме), включает следующие токсиколого-аллергологические эксперименты.
При нормировании по аналогии проводят сравнение выраженности и частоты сенсибилизации у животных, вызванных введением референс-аллергена и изучаемого вещества, используя методы экспресс-сенсибилизации I-го этапа. При нормировании нерастворимых пылей возможно также применение внутритрахеальной сенсибилизации белых крыс. Для простых химических соединений референс-аллергеном является уже нормированное вещество, сходное по своей химической структуре и содержащее одинаковые ответственные за развитие сенсибилизации активные химические группы. Референс-аллергеном для сложной композиции служит уже нормированная композиция, близкая по составу и содержащая одинаковый ответственный за развитие сенсибилизации ингредиент.
При отсутствии референс-аллергена II-й этап исследований включает экспериментальное определение порогов сенсибилизации: при однократной ингаляции вещества - Lim sens ас , при многократных ингаляциях - Lim sens ch . Сравнение величин Lim sens ас и Lim sens ch с Lim ас и Lim ch , установленных в токсикологических экспериментах по интегральным и специфическим эффектам, позволяет определить, является ли сенсибилизирующее действие лимитирующим. С учетом этих данных обосновывают величину гигиенического норматива (см. раздел 6).
При нормировании сложных химических продуктов сенсибилизацию животных на обоих этапах исследования осуществляют цельным продуктом; при выявлении сенсибилизации для тестирования применяют все основные ингредиенты в чистом виде, а при неизвестном составе - цельный продукт или вытяжку из него (см. раздел 5.3).
^ 3. Постановка исследований по выявлению аллергенных свойств
3.1. Внутрикожная сенсибилизация морских свинок
В эксперименте используют молодых морских свинок массой 250 - 300 г, разделенных на 2 опытных и одну общую контрольную группы по 8 - 10 животных в каждой. Животных опытных групп сенсибилизируют, вводя однократно в кожу наружной поверхности уха ближе к его основанию 50 (1-я опытная группа) и 200 мкг на животное (2-я опытная группа) изучаемое вещество в объеме 0,02 - 0,1 мл. В качестве растворителей применяют дистиллированную воду, физиологический раствор, ацетон, спирт, твин-80, диметилсульфоксид и др. При изучении маслообразных продуктов используют водные эмульсии, а для отвержденных полимеров - вытяжки (см. раздел 5.3). Контрольным животным вводят в том же объеме растворитель, эмульгатор или экстрагирующую жидкость.
Выявление сенсибилизации (см. раздел 5) проводят через 8 - 10 дней. Сильные аллергены в обеих дозах вызывают у морских свинок выраженную сенсибилизацию: среднегрупповой показатель аллергологических тестов статистически достоверно отличается от такового у контрольных животных. Умеренные аллергены выраженную сенсибилизацию вызывают лишь при введении в дозе 200 мкг на животное, а при введении 50 мкг на животное - слабую, при которой сенсибилизация обнаруживается у 1/3 - 1/2 части животных, а среднегрупповые показатели аллергологических тестов могут не отличаться от таковых у контрольных животных. Слабые аллергены вызывают слабую сенсибилизацию лишь при введении вещества в дозе 200 мкг на животное, при этом положительными могут быть лишь тесты с клетками крови, а кожные пробы - отрицательными.
^ 3.2. Комбинированная сенсибилизация морских свинок
Сложные продукты и подтвержденные полимеры могут очень плохо всасываться, и в этом случае сенсибилизация у морских свинок не наступает даже при введении в кожу уха 200 мкг/жив. Для окончательного решения о наличии аллергенных свойств при отрицательных результатах аллергологического тестирования животных на следующий день начинают эпикутанные аппликации вещества. После 7-й аппликации повторно проводят тестирование морских свинок.
Концентрацию вещества для эпикутанных аппликаций подбирают в процессе изучения раздражающего кожу действия или в специальном эксперименте: 6 - 8 морским свинкам массой 250 - 300 г в течение 7 - 10 дней (по 5 раз в неделю) наносят по 3 капли изучаемого вещества и его разведений 1:2, 1:10 и 1:100 на выстриженные "окошки" боковой поверхности туловища размером 2 х 2 см. В качестве растворителя удобно использовать летучий не раздражающий кожу растворитель (ацетон, 70°-ный спирт, диметилсульфоксид). Если образуется пленка, то ее через 4 часа смывают, в остальных случаях кожу ничем не обрабатывают. Из нерастворимых веществ готовят мази (лучше на ланолине, а не на вазелине), которые распределяют глазной лопаточкой по поверхности "окошка". Для сенсибилизации выбирают максимальную концентрацию, не вызвавшую развития контактного дерматита.
^ 3.3. Определение ГЗТ на мышах
В опытную и контрольную группы берут по 10 мышей чистой линии (BALB/C, СА-1, ДВА/2) или по 16 - 20 белых беспородных мышей массой 18 - 20 г. Животных сенсибилизируют 10 мМ или 100 мкг изучаемого вещества однократно внутрикожно в основание хвоста. Сенсибилизирующая доза вещества эмульгируется в 60 мкл смеси полного адъюванта Фрейнда (ПАФ) и раствора Хенкса рН 7,5, приготовленной в соотношении 1:1. Состав ПАФ: 1 мл ланолина, 3 мл вазелинового масла, 5 мг убитой нагреванием вакцины БЦЖ. В этот объем ПАФ добавляют 50 мкл твина-20 и 0,5 мл дистиллированной воды. Смесь автоклавируют. Контрольным животным вводят 60 мкл данной смеси без добавления изучаемого вещества.
Для выявления сенсибилизации через 5 суток в подушечку задней лапы мышей вводят такое же, как и при сенсибилизации, количество изучаемого вещества (10 мМ или 100 мкг), растворенного (взвешенного) в растворе Хенкса. Через 24 часа измеряют инженерным микрометром МК-0-25 толщину обеих задних лап в мм. О величине отека, т.е. о развитии ГЗТ судят по разнице в толщине обеих задних лап (показатель ГЗТ). У контрольных животных она, как правило, составляет 0,04 - 0,09 мм. Статистически достоверное превышение среднегруппового показателя ГЗТ опытных животных по сравнению с контрольными свидетельствует о наличии выраженных или умеренных сенсибилизирующих свойств у изучаемого соединения.
^ 3.4. Многократные эпикутанные аппликации на морских свинках
Подбор сенсибилизирующей концентрации осуществляют также, как при комбинированной сенсибилизации (см. раздел 3.2). Эпикутанные аппликации проводят по 5 раз в неделю в течение 4 недель (всего 20 аппликаций). Если на 2 - 3-й неделе опыта у морских свинок появляются признаки контактного дерматита, то сенсибилизирующие аппликации продолжают на другом участке кожи. Выявление сенсибилизации проводят через 1 - 2 суток после последней аппликации. При этом капельную кожную пробу ставят на противоположном боку.
^ 4. Постановка исследований по обоснованию величины гигиенических нормативов
4.1. Интратрахеальная сенсибилизация белых крыс
Двум группам белых крыс вводят однократно в трахею 0,5 - 1,0 мл суспензии максимально измельченной изучаемой пыли в дозах по 50 и 10 мг на подогретом до 37 °С физиологическом растворе. Животным контрольной группы вводят по 1 мл подогретого до 37 °С физиологического раствора.
Процедуру введения лучше осуществлять без наркоза. Для этого крысу фиксируют в вертикальном положении, вводят в ротовую полость металлический зонд, закрепленный на шприце с соответствующей дозой суспензии, проводят его по передней стенке гортани через голосовую щель (возникает ощущение препятствия) до упора в бифуркацию трахеи, слегка приподнимают зонд и осуществляют введение. После введения животное продолжают держать, в вертикальном положении на протяжении нескольких дыхательных движений. При этом хрипы и хлюпающий звук подтверждают проникновение суспензии в легкие.
Тестирование животных всех групп проводят через 5 суток после интратрахеального введения.
^ 4.2. Однократное ингаляционное воздействие
Однократные ингаляции вещества с целью определения величины Lim sens ас целесообразно проводить на морских свинках или белых крысах после нахождения величины Lim ас . Для слабых и умеренных аллергенов обычно достаточно проводить ингаляции изучаемого вещества в концентрациях на уровне действующей, пороговой и на порядок ниже таковой по общетоксическому эффекту. При изучении сильных аллергенов приходится еще проводить ингаляции в меньших концентрациях. Длительность каждой ингаляции составляет при установлении нормативов для воздуха рабочей зоны 4 часа, для атмосферного воздуха - 24 часа. Число животных в группе должно быть не менее 10.
Однократные ингаляции следует проводить на крысах с тем, чтобы можно было сравнить величины Lim sens ас и Lim ас , полученные на одном виде животных. Однако, если на крысах однократная ингаляция не вызывает сенсибилизации, то ее надо повторить на морских свинках.
Выявление сенсибилизации осуществляют через неделю после проведения ингаляции.
За Lim sens ас принимают концентрацию вещества, однократная ингаляция которой вызывает сенсибилизацию у 2 - 5 из 10 животных, проявляющуюся положительными лабораторными тестами и/или провокационными пробами. При этом среднегрупповые значения показателей сенсибилизации могут статистически достоверно не отличаться от контрольных.
^ 4.3. Многократное ингаляционное воздействие
Многократные ингаляции проводят на животных того же вида, на которых установили Lim sens ас . Продолжительность воздействия составляет: при установлении ПДК в воздухе рабочей зоны 4 часа ежедневно 5 раз в неделю в продолжении 2-х недель, для ПДК в атмосферном воздухе 14 суток непрерывного (круглосуточного) воздействия. Соответственно через 2 недели проводят первое тестирование животных. При отрицательном или сомнительном результате ингаляции продолжают еще 2 недели и том же режиме и проводят повторное тестирование. При установлении ПДК в воздухе рабочей зоны общая продолжительность воздействия не должна превышать одного месяца, а для атмосферного воздуха опыт может быть продолжен до 2-х месяцев. Более длительное воздействие нецелесообразно, поскольку оно не ведет к усилению сенсибилизирующего эффекта. Более того, последующие ингаляции могут привести к ослаблению эффекта из-за развития компенсаторных иммунных процессов и существенно затруднят определение пороговой концентрации. Таким образом, 2 - 4-недельный эксперимент по своему эффекту в принципе равнозначен хроническому токсикологическому эксперименту, что позволяет проводить сравнение величин Lim ch и Lim sens ch .
Определение пороговой концентрации по сенсибилизирующему эффекту (Lim sens ch ) проводят по тем же принципам, что и при однократном ингаляционном воздействии.
^ 5. Методы выявления сенсибилизации
В настоящем документе рекомендованы широко апробированные в токсикологической практике приемы выявления сенсибилизации к химическим соединениям и продуктам: кожные провокационные пробы и лабораторные специфические аллерготесты, основанные на реакции клеток крови на аллерген in vitro. Эти тесты позволяют выявить аллергические реакции разного типа: замедленные (провокационная капельная кожная проба), немедленные реагинового типа (тесты с тучными клетками), а также опосредованные иммунными комплексами (лизис лейкоцитов и тесты с нейтрофилами крови). Рекомендуемые тесты не должны ограничивать инициативу исследования, так как правомерно использование и других методов как специфической аллергодиагностики, так и неспецифических, свидетельствующих о развитии сенсибилизации у подопытных животных (иммунологических, биохимических, иммуноморфологических и др.).
^ 5.1. Провокационная кожная капельная проба на морских свинках
Для проведения кожной капельной пробы (далее - КП) предварительно проводят подбор тестирующей концентрации и изучаемого вещества на группе интактных морских свинок (6 - 8 особей). Для этого на боковых поверхностях туловища животного выстригают шерсть на 4 - 8 участках размером 1 х 1 см, разделенных полосками шерсти. На соответствующий участок наносят по 1 - 3 капли вещества в определенной концентрации. Обычно испытывают вещество в нативном виде и его двукратные или десятикратные разведения. В качестве растворителя (разбавителя) используют воду, 70°-ный спирт, ацетон, диметилсульфоксид. При этом один из участков кожи должен быть контрольным, на который наносят соответствующий растворитель (разбавитель). Реакцию учитывают визуально через 24 часа.
В качестве тестирующей концентрации выбирают максимальную, нанесение которой на кожу интактных морских свинок не вызывает через 24 часа реакцию раздражения (эритемы, опухания).
Постановка КП. На лишенную шерсти кожу бока морских свинок (опытных и контрольных) наносят по 1 капле изучаемого вещества в тестирующей концентрации. Реакцию оценивают визуально через 24 часа по следующей шкале:
0 баллов - видимой реакции нет;
1 балл - слабо-розовая эритема по всему участку или по периферии;
2 балла - ярко-розовая эритема по всему участку или по периферии;
3 балла - ярко-красная эритема по всему участку;
4 балла - опухание кожи с эритемой или без нее;
5 баллов - выраженное опухание, очаговые изъязвления, геморрагии.
^ 5.2. Провокационный тест опухания уха
Подбор тестирующей концентрации для ТОУ в принципе не отличается от такового для КП: используются те же растворители (ацетон, 70°-ный спирт) и разведения вещества (от 0,1 до 20%, реже 50% или неразведенный продукт). Однако общее число животных увеличивают, так как на одном животном можно испытывать только две концентрации (по одной на каждое ухо).
Постановка ТОУ: предварительно измеряют микрометром в мм толщину средней части ушной раковины, затем на обе поверхности средней трети расправленного и фиксированного пинцетом ушка наносят по 25 мкл испытуемого вещества в рабочей концентрации. Через 24 часа повторно замеряют толщину ушка и вычисляют показатель ТОУ по различию толщины до и после аппликации. ТОУ считают положительным у морских свинок и крыс при показателе 0,03 мм и более, у мышей - 0,01 мм и более. У морских свинок ТОУ можно учитывать в баллах по следующей шкале:
0 баллов - до 0,03 мм;
1 балл - 0,03 - 0,07 мм;
2 балла - 0,08 - 0,12 мм;
3 балла - 0,13 - 0,17 мм;
4 балла - 0,18 - 0,22 мм;
5 баллов - 0,23 мм и более.
^ 5.3. Подбор рабочих доз вещества для постановки специфических аллерготестов с клетками крови животных
Специфические аллерготесты с клетками крови, как правило, выполняют с 0,1 - 0,01%-ными растворами (на физиологическом растворе), поэтому в них можно использовать малорастворимые вещества. Для веществ, не растворяемых в воде даже в таких концентрациях, следует подобрать водорастворимое вещество, имеющее групповую антигенную детерминанту: например, для формальдегидсодержащих полимерных продуктов - растворы формальдегида; для полимерных продуктов, содержащих эпоксигруппы - эпихлоргидрин; для всех соединений хрома – CrCl 3 ; для металла Ве и его соединений - сульфат бериллия и т.д. При изучении отвержденных полимеров используют вытяжку: изучаемое вещество и физиологический раствор в соотношении 1:1 для полимеризационных и 1:10 для поликонденсационных продуктов при инкубации при 37 °С в течение 3 - 5 суток.
Растворы желательно приготавливать не из технических продуктов, а из химически чистых веществ. Поскольку кислая или щелочная среда может вызвать повреждение клеток крови, следует следить, чтобы рН рабочего раствора была нейтральной или слабо щелочной (рН 7,2 - 7,4). Если вещество образует нестойкий раствор, рабочие растворы необходимо готовить для каждого опыта. Стойкие растворы можно хранить в холодильнике и течение месяца, однако при этом следует следить за их стерильностью и в случае помутнения или образовании пленки раствор использовать нельзя.
Рабочие дозы (концентрации растворов) испытуемых веществ подбирают путем постановки теста с кровью интактных животных, используя несколько разведений. Для выявления сенсибилизации выбирают максимальную концентрацию раствора, не вызывающую увеличения лизиса или других соответствующих тесту изменений клеток крови по сравнению с контрольной пробой с добавлением только антикоагулянта.
^ 5.4. Реакция специфического лизиса лейкоцитов крови
Вариант 1. В первую пробирку или лунку планшета вносят 0,1 мл физиологического раствора (контрольная проба), во вторую - 0,1 мл физиологического раствора, в котором предварительно растворена рабочая доза испытуемого вещества (опытная проба). Затем в обе пробирки добавляют по 0,1 мл исследуемой крови. Реагирующие системы перемешивают встряхиванием и инкубируют в течение 2 часов при 37 °С. Из каждой пробы кровь переносят по 0,02 мл соответственно в две пробирки или лунки планшета, содержащие для разрушения эритроцитов по 0,4 мл 3%-ного водного раствора уксусной кислоты.
Вариант 2. В два меланжера до метки 0,5 набирают кровь экспериментальных животных, затем в первый меланжер до метки 1 добавляют 5%-ный раствор лимоннокислого натрия, приготовленный на физиологическом растворе (контрольная проба), во второй (до той же метки I) - 5%-ный раствор лимоннокислого натрия, в котором предварительно растворена рабочая доза испытуемого вещества (опытная проба). Меланжеры встряхивают и инкубируют при 37 °С в течение 2-х часов. Затем в оба меланжера до метки II набирают 3 - 5%-ный водный раствор уксусной кислоты, подкрашенный метиленовым синим.
Подсчет абсолютного количества лейкоцитов проводят в счетной камере крови или на пикаскеле. При использовании меланжеров до заполнения камеры предварительно сливают 3 - 4 капли.
Показатель РСЛЛ рассчитывают по формуле:
Реакцию расценивают как положительную при показателе лизиса лейкоцитов 10% и выше. Показатель РСЛЛ выше 20% свидетельствует о высоком уровне сенсибилизации животных.
Рабочие концентрации химических аллергенов не должны вызывать лизис более 9% лейкоцитов интактных животных и наиболее часто соответствуют 0,5 - 0,05%-ным разведениям на физиологическом растворе; более высокого разведения требуют вещества, обладающие выраженным раздражающим, а следовательно, цитотоксическим действием на клетки крови.
^ 5.5. Реакция специфического повреждения нейтрофилов
Для постановки реакции специфического повреждения нейтрофилов (далее - тест ППН) в качестве антикоагулянта применяют 5%-ный водный раствор цитрата натрия или 1,5%-ный раствор ЭДТА (Хелатон-3), приготовленный на физиологическом растворе (следить за рН раствора).
Рабочую концентрацию изучаемого вещества готовят на том же антикоагулянте, который добавляют к крови. Рабочая концентрация не должна вызывать повреждение более чем 4% нейтрофилов интактных животных в 1-м варианте теста ППН и 7% во 2-м варианте.
Постановка теста ППН. В первую силиконированную центрифужную пробирку (опытная проба) вносят 0,1 - 0,2 мл раствора изучаемого вещества в рабочей концентрации, во вторую (контрольная проба) - такой же объем только антикоагулянта. Затем в обе пробирки добавляют такой же объем крови обследуемого животного, после чего пробирки осторожно перемешивают и выдерживают в течение 1 ч при комнатной температуре.
Вариант 1. После окончания инкубации из обеих пробирок готовят на предметном стекле мазки средней толщины, которые фиксируют и окрашивают методом, используемым при окраске мазков для подсчета лейкоцитарной формулы. Под иммерсией просчитывают 100 нейтрофилов, учитывая число клеток с отчетливым хроматинолизом, пикнозом, фрагментацией ядер, гиперхроматозом или кариолизисом.
Вариант 2. После окончания инкубации снова осторожно перемешивают и добавляют в обе пробирки по 0,02 мл рабочего водного раствора акридина оранжевого (1:20000). Данный раствор хранят в холодильнике не более 2-х недель. Для его приготовления используют йодный раствор акридина оранжевого в разведении 1:100, который можно хранить в темном флаконе в холодильнике несколько месяцев. Через 5 минут по 1 капле содержимого из каждой пробирки переносят на два предметных стекла, накрывают покровным стеклом и через 3 - 5 минут исследуют в ЛЮМАМе с иммерсией. Подсчитывают 100 нейтрофилов, которые хорошо определяются благодаря обилию рубиновых гранул на фоне тусклого зеленого свечения цитоплазмы.
Нормальные неповрежденные нейтрофилы имеют овальную или круглую форму. Поврежденные нейтрофилы распознают по характерным амебоидным выпячиваниям (увеличение подвижности клеток) и морфологическим изменениям (неровные "разорванные" края с начинающимся разрежением цитоплазмы по краям клетки, вакуолизация цитоплазмы, дегрануляция, огрубление хроматинового рисунка ядра).
Показатель реакции высчитывают путем деления на 100 разницы в числе поврежденных нейтрофилов в опытной и контрольной пробах. Величина показателя 0,05 и более в первом варианте и 0,08 и более во втором варианте свидетельствует о сенсибилизации животного.
^ 5.6. Реакция специфической дегрануляции тучных клеток
Исследование выполняют под наркозом или сразу после декапитации животного. Для этого ножницами вскрывают брюшную стенку по средней линии и осторожно (лучше пальцами в резиновых напальчниках, а не пинцетом) вытягивают наружу наиболее длинную петлю перистальтирующего кишечника (5 см или несколько длиннее). Раскладывают петлю на подставленное предметное стекло так, чтобы раскрылись 3 крупных сегмента брыжейки. После этого отсекают с двух сторон участок петли кишечника, края которого должны на 0,5 см свешиваться за край стекла. Затем на каждый сегмент первого контрольного препарата наносят по 40 мкл физиологического раствора, а на каждый сегмент второго опытного препарата наносят по 20 мкл свежей аутосыворотки (приготовленной в день исследования из крови, взятой из подъязычной вены) и по 20 мкл изучаемого вещества в рабочей концентрации, приготовленной на физиологическом растворе. Оба препарата инкубируют 5 минут при 37 °С, удаляют жидкую фазу путем промокания фильтровальной бумагой края наклоненного стекла и при необходимости еще раз осторожно расправляют брыжейку. Сразу производят окраску препаратов, заливая их на 1 - 1,5 минуты 1%-ным раствором на метиловом спирте эозинметиленового красителя (по Май-Грюнвальду). Краску удаляют промыванием слегка наклоненного препарата водой из пипетки и оставляют до полного просушивания на воздухе (обычно 24 часа). На высушенном препарате скальпелем удаляют весь участок кишечника и перегородки между секторами брыжейки.
Микроскопируют препараты с иммерсией (увеличение 10 х 80), просчитывают по диагонали 50 тучных клеток, учитывая среди них поврежденные формы. Поврежденными следует считать тучные клетки с нарушенной мембраной и выходом гранул за ее пределы (дегрануляция), а также полностью поврежденные. Рассчитывают показатель РДТК по формуле:
Реакцию расценивают как положительную при показателе 1,31 и выше.
Рабочие концентрации химических веществ для РДТК наиболее часто соответствуют 0,01 - 0,001%-ным разведениям на физиологическом растворе, при действии которых у контрольных животных показатель ДТК не должен превышать 1,0 0,3.
^ 5.7. Реакция непрямой дегрануляции тучных клеток
Данный тест (далее - РНТДК) основан на реакции клеток-мишеней (тучные клетки белых крыс) на воздействие на них in vitro аллергических антител, содержащихся в сыворотке крови подопытных животных, и изучаемого вещества (аллергена).
Для получения пула тучных клеток интактным белым крысам под эфирным наркозом вводят внутрибрюшинно 6 - 10 мл подогретого до 37 °С физиологического раствора, смешанного с 0,5 мл гепарина. После легкого массажа брюшной стенки ножницами делают разрез длиной 1,5 - 2,2 см по средней линии живота, переворачивают тушку разрезом вниз и собирают экссудат, стекающий с петель кишечника, в центрифужную пробирку, смоченную гепарином. Экссудат центрифугируют в течение 5 мин. при 1500 об./мин., надосадок сливают, а осадок для получения взвеси тучных клеток перемешивают.
Для выполнения РНДТК в 2 лунки планшета или 2 пробирки вносят по 0,05 мл взвеси тучных клеток и 0,05 мл сыворотки обследуемого животного. Затем в 1-ю пробу (контрольную) добавляют 0,05 мл физиологического раствора, во 2-ю пробу (опытную) - 0,05 мл физиологического раствора, в котором растворена рабочая доза изучаемого вещества (0,01 - 0,001%-ные растворы, которые не должны вызывать спонтанного повреждения более 5% клеток-мишеней). Затем на одно обезжиренное предметное стекло, предварительно окрашенное на 2-х концах стекла в виде квадратов, 0,3%-ным спиртовым раствором нейтрального красного и высушенного при комнатной температуре, наносят по капле из каждой пробы. Каждую каплю накрывают покровным стеклом, края которого смазаны вазелином, и инкубируют при 37 °С в течение 15 мин.
Препараты микроскопируют при увеличении 20 х 80. В каждом препарате подсчитывают 50 тучных клеток. Вычисление показателя РНДТК и его оценку проводят как и в разделе 5.6 при постановке РДТК.
^ 5.8. Оценка результатов выявления сенсибилизации
При проведении исследований I-го этапа оценивают частоту развития сенсибилизации и ее интенсивность по среднегрупповым показателям всех использованных провокационных и специфических аллергологических тестов. Класс аллергенной активности изучаемого вещества определяют по табл. 1: к 1-му классу относят сильные, ко 2-му - умеренные и к 3-му - слабые аллергены. В случае различия эффекта по частоте проявления сенсибилизации и величинам среднегрупповых показателей различных провокационных и/или специфических аллергологических тестов аллергенную активность вещества оценивают по наиболее выраженному показателю.
Таблица 1
^ КЛАССИФИКАЦИЯ ВЕЩЕСТВ ПО СИЛЕ АЛЛЕРГЕННОЙ АКТИВНОСТИ
| Метод сенсибилизации | Классы аллергенной активности |
|||||
| по частоте развития сенсибилизации | по достоверности отличия среднегрупповых показателей в опытных и контрольной группах |
|||||
| 1 | 2 | 3 | 1 | 2 | 3 |
|
| Морские свинки - 200 мкг | > 5 из 10 | > 5 из 10 | £ 5 из 10 | £ 0,05 | £ 0,05 | > 0,05 |
| в кожу уха 50 мкг | > 5 из 10 | 5 из 10 | 0 | £ 0,05 | > 0,05 | - |
| Морские свинки - комбинированно | > 5 из 10 | > 5 из 10 | £ 5 из 10 | £ 0,05 | £ 0,05 | > 0,05 |
| Морские свинки - опикутанно | > 5 из 10 | > 5 из 10 | £ 5 из 10 | £ 0,05 | £ 0,05 | > 0,05 |
| Мыши - в кожу основания хвоста | не учитывают | £ 0,05 | £ 0,05 | > 0,05 |
||
При проведении ингаляционных экспериментов II этапа исследований за действующую концентрацию принимают такую, при действии которой сенсибилизация развивается более чем у половины животных, а среднегрупповые показатели аллергологических тестов статистически достоверно отличаются от таковых у контрольных животных. За пороги острого и хронического сенсибилизирующего действия принимают концентрации, при действии которых (одно- или многократно соответственно) сенсибилизация развивается у 2 - 5 из 10 животных, причем среднегрупповые показатели существенно не отличаются от таковых у контрольных животных.
^ 6. Обоснование величины гигиенических нормативов
Обоснование величины санитарного стандарта промышленного химического аллергена при проведении полной схемы исследований начинают со сравнения Lim sens ch с Lim ch . В зависимости от их соотношения определяют прием обоснования ПДК и наличие пометки А (аллерген).
При установлении ПДК в воздухе рабочей зоны руководствуются следующими положениями.
Если лимитирующим критерием является токсичность, т.е. величины порогов сенсибилизации выше величин порогов токсичности, то вещество практически не представляет опасности как аллерген, и его нормируют как обладающее общетоксическим действием; при этом пометка А (аллерген) не ставится.
Если пороговые величины общетоксического и сенсибилизирующего действия существенно не отличаются или равны, то вещество следует рассматривать как потенциально опасное в плане развития токсикоаллергических поражений и его нормируют по общетоксическому действию, сопровождая пометкой А (аллерген).
Если лимитирующим критерием является сенсибилизация, т.е. величины порогов сенсибилизации ниже пороговые величин токсичности, то вещество представляет опасность как этиологический фактор аллергических заболеваний, его расценивают как промышленный химический аллерген и нормируют по сенсибилизирующему действию с пометкой А (аллерген). При этом коэффициент запаса для химического аллергена определяют по табл. 2.
Таблица 2
^ КОЭФФИЦИЕНТЫ ЗАПАСА К Lim sens ch ПРИ УСТАНОВЛЕНИИ ПДК В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ
При установлении ПДК вредных веществ, обладающих сенсибилизирующим действием, в атмосферном воздухе рекомендуются более строгие критерии, учитывая, что воздействию подвергаются дети, люди пожилого возраста и лица, имеющие различные заболевания. В этом случае учитывают не только величину порога хронического сенсибилизирующего действия, но также зону хронического сенсибилизирующего действия, определяемую по формуле:
.
Далее в соответствии с величиной Z sens ch определяют коэффициент запаса к Lim sens ch по табл. 3 Полученную величину ПДК по сенсибилизирующему эффекту сравнивают с ПДК по общетоксическому действию и в качестве гигиенического норматива выбирают наименьшую величину ПДК. Пометку А (аллерген) ставят в соответствии с принципами обоснования ПДК в воздухе рабочей зоны.
Таблица 3
^ КОЭФФИЦИЕНТЫ ЗАПАСА К Lim sens ch ПРИ УСТАНОВЛЕНИИ ПДК В АТМОСФЕРНОМ ВОЗДУХЕ
Так, если величины порогов хронического, токсического и сенсибилизирующего совпадают и составляют 0,01 мг/м 3 , то Z sens ch будет равна 1,0. В этом случае согласно табл. 3 коэффициент запаса по сенсибилизирующему действию не может быть менее 3,0, а величина ПДК составит 0,003 мг/м 3 . Если по токсичности положен коэффициент запаса, равный 2,0, т.е. величина ПДК составит 0,005 мг/м 3 , рекомендуется наименьшая величина ПДК, т.е. 0,003 мг/м 3 . Но если в разбираемом примере коэффициент запаса по токсичности должен быть не менее 5,0, т.е. определенная по данному эффекту величина будет еще меньше (0,002 мг/м 3), то выбирается она.
При обосновании ОБУВ ускоренным методом, т.е. по величине рассчитывают зону сенсибилизирующего действия вещества по нижеприведенной формуле и уменьшают величину ОБУВ, рассчитанную по общетоксическому действию, во столько раз, сколько составляет Z sensас .
.
Так, если расчетным путем по токсичности определена величина ОБУВ как 0,2 мг/м 3 , а Z sens ас равна 4, то ОБУВ испытуемого вещества с учетом сенсибилизирующего действия составит 0,05 мг/м 3 (0,2:4). Пометку А (аллерген) ставят в соответствии с принципами, используемыми при обосновании ПДК.
При нормировании по аналогии в случае совпадения частоты и интенсивности сенсибилизации, вызванной веществом, с таковыми от воздействия референс-аллергена, ПДК или ОБУВ устанавливают на уровне величины норматива референс-аллергена с пометкой А (аллерген). При существенном отклонении частоты и интенсивности сенсибилизации по сравнению с таковыми от воздействия референс-аллергена проводят II этап исследований и руководствуются вышеизложенными положениями обоснования величины ПДК или ОБУВ.
Класс опасности определяют по общепринятым в профилактической токсикологии правилам.
Клинико-гигиеническую проверку безопасности величины ПДК, установленной в эксперименте на животных, осуществляют путем сравнения условий труда и состояния здоровья работающих с использованием общепринятых в профилактической токсикологии приемов, а также на основании эпидемиолого-аллергологического обследования работающих, включая выборочное специфическое иммуноаллергологическое тестирование с целью выявления частоты и выраженности сенсибилизации к данному производственному аллергену.
Приложение
(Справочное)
^ БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ СВЕДЕНИЯ
1. Постановка исследований по гигиеническому нормированию промышленных аллергенов в воздухе рабочей зоны. Методические рекомендации № 2121-80 от 23.01.1980. Минздрав СССР. Рига, 1980.
2. Временные методические указания по обоснованию предельно допустимых концентраций загрязняющих веществ в атмосферном воздухе населенных мест № 4681-88. Минздрав СССР. М, 1989.
3. Методы лабораторной специфической диагностики профессиональных аллергических заболеваний химической этиологии. Методические рекомендации № 10-8/94 от 25.12.1979 Минздрав СССР. М, 1980.
4. Алексеева О.Г., Дуева Л.А. Аллергия к промышленным химическим соединениям. М.: Медицина, 1978. - 242 с.
5. Дуева Л.А., Коган В.Ю., Суворов С.В., Штеренгарц Р.Я. Промышленные аллергены. М. Центр Международных Проектов Госкомприроды СССР. М., 1989. - 203 с.
Изобретение относится к области биотехнологии. Способ включает выявление в благополучных хозяйствах и дворах плановыми аллергическими исследованиями реагирующих на туберкулин животных. От положительно реагирующих на туберкулин животных исследуют кровь реакцией специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ) с использованием в качестве диагностикума туберкулинов ППД для млекопитающих, ППД для птиц и КАМ. Способ позволяет провести дифференциацию специфических и неспецифических положительных реакций на туберкулиновую пробу и диагностировать туберкулез на ранней стадии заболевания. 4 з.п. ф-лы, 7 табл.
Изобретение относится к ветеринарии, в частности к экспресс-способам дифференциальной диагностики туберкулеза, вызываемого микобактериями разных видов.
Известно, что в благополучных хозяйствах первичный диагноз на туберкулез устанавливают комплексным способом - эпизоотологическим, клиническим, аллергическим, патологоанатомическим и лабораторным (1.)
Перечисленные способы диагностики во многих случаях не позволяют в короткие сроки исследования поставить окончательный диагноз на туберкулез.
Для массовых прижизненных исследований на туберкулез используют аллергическую диагностическую пробу (2). Однако появление массовых неспецифических реакций на туберкулин у нетуберкулезных животных не позволяет поставить в благополучных хозяйствах диагноз на туберкулез по положительной туберкулиновой пробе (1; 2).
Для дифференциации неспецифических туберкулиновых реакций ставят симультанную пробу (прототип) с двумя аллергенами - ППД для млекопитающих и аллергеном КАМ, изготовленным из нескольких штаммов атипичных микобактерий (2; 3; 4).
Симультанную аллергическую пробу применяют при первичной постановке диагноза на туберкулез крупного и мелкого рогатого скота и кур в благополучных хозяйствах и в случае, если реакции на туберкулин обусловлены атипичными микобактериями и кислотоустойчивыми сапрофитами (3).
Владельцы высокоудойных коров оспаривают правомерность контрольно-диагностического убоя животных, давших положительную реакцию на туберкулиновую пробу, и требуют прижизненных способов диагностики для переисследования высокопродуктивных животных на туберкулез. Использование предлагаемого нами «Способа ранней диагностики туберкулеза животных» вносит ясность в этот спорный вопрос, так как позволяет установить однозначно специфичность или неспецифичность реакции организма животного на внутрикожное введение туберкулина и окончательно поставить диагноз.
Более того, проведение симультанной пробы допускается через 30 и более дней после последней туберкулинизации животных, что не отвечает требованиям ранней (доклинической) диагностики туберкулеза в короткие сроки исследования.
Таким образом, недостатками известных способов постановки диагноза на туберкулез являются трудоемкость, продолжительные сроки исследования и невозможность определения вида микобактерий в первые дни после заражения.
Способ основан на немедленно появляющейся повышенной чувствительности лейкоцитов к повторному контакту с антигеном (аллергеном) вне организма. Целью изобретения является разработка нового способа. Поставленная задача достигается использованием реакции специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ).
Способ осуществляется путем исследования крови РСЛЛ от положительно реагирующих на туберкулин животных, выявленных в благополучных хозяйствах и дворах плановыми аллергическими исследованиями, с использованием в качестве диагностикума туберкулинов (ППД для млекопитающих, ППД для птиц и КАМ).
Причем при диагностике туберкулеза у крупного рогатого скота РСЛЛ проводится с ППД-туберкулином для млекопитающих, ППД-туберкулином для птиц и КАМ - комплексным аллергеном из атипичных микобактерий.
Диагностику туберкулеза у свиней выполняют с ППД-туберкулином для млекопитающих и ППД-туберкулином для птиц.
При диагностике туберкулеза у собак и плотоядных РСЛЛ используют ППД-туберкулин для млекопитающих.
Диагностику туберкулеза у кроликов и пушных зверей РСЛЛ проводят с ППД-туберкулином для млекопитающих, ППД-туберкулином для птиц и КАМ.
Организация исследований на туберкулез РСЛЛ
В опытах на кроликах, собаках, свиньях и телятах для сенсибилизации организма животных использовали живые микобактерии вакцинного штамма БЦЖ-1 в прививочных дозах: одна (0,05 мг), две (0,1 мг), три (0,15 мг), пять (0,25 мг) и десять (0,50 мг).
Исследования проводили в экспериментальных условиях на лейкоцитах крови интактных вакцинированных БЦЖ животных и в производственных условиях - коровах, дважды давших положительную реакцию на внутрикожное введение ППД-туберкулина для млекопитающих, в СПК « Рассвет» Матвеево-Курганского района.
Основная цель исследований - использовать результаты РСЛЛ для дифференциальной диагностики и определения:
1) сенсибилизации лейкоцитов организма животных микобактериями вакцины БЦЖ;
2) инфицирования коров, давших дважды положительную туберкулиновую реакцию;
3) неспецифических реакций на туберкулин при его внутрикожном введении.
В опыт отобрали клинически здоровых интактных животных, которые служили фоновым контролем. Группы формировали животными, у которых при 3-кратном исследовании проб крови получены стабильные величины значений гематологических показателей (количество лейкоцитов,% лизиса и др.).
В каждую опытную группу брали не менее трех животных. От каждого животного брали кровь, которую делили на контрольную и опытные пробы. В контрольной пробе к крови добавляли 0,9% физиологический раствор натрия хлорида, а в опытных пробах крови - туберкулины - ППД для млекопитающих, ППД для птиц и КАМ.
Для исключения ошибок внимания техники подсчета форменных элементов и получения достоверных средних величин значений показателей реакции крови каждую пробу (контрольную и опытные) исследовали в трех повторах.
Порядок проведения исследования на туберкулез РСЛЛ
Исследование животных на туберкулез вначале проводят методом туберкулинизации в порядке и сроки, предусмотренные «Эпизоотическим контролем и постановкой диагноза на туберкулез у животных разных видов» (2).
В качестве диагностикумов берут ППД-туберкулин для млекопитающих, ППД-туберкулин для птиц и комплексный аллерген из атипичных микобактерий (КАМ).
В благополучных по туберкулезу гуртах, группах и отдельных животных основным методом исследования является внутрикожная туберкулиновая проба. В случае выявления животных, реагирующих на туберкулин, то положительно реагирующих изолируют, ставят на привязь и берут от них кровь для исследования в реакции специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ) со следующими диагностикумами:
У крупного рогатого скота антикоагулянтную кровь в РСЛЛ берут с
а) физиологическим раствором хлористого натрия (контрольная проба);
г) ППД-туберкулином для птиц.
При этом животных, давших положительные результаты исследования РСЛЛ с ППД-туберкулином для млекопитающих, считают туберкулезными
У свиней антикоагулянтную кровь в РСЛЛ берут с
а) физиологическим раствором поваренной соли;
б) ППД-туберкулином для млекопитающих;
в) ППД-туберкулином для птиц.
Свиней, у которых РСЛЛ с ППД-туберкулином для млекопитающих оказалась положительной, признают туберкулезными, а животных, у которых РСЛЛ положительна с ППД-туберкулином для птиц, считают инфицированными микобактериями птичьего вида;
У собак и др. мелких животных РСЛЛ берут с
а) физиологическим раствором;
б) ППД-туберкулином для млекопитающих;
У кроликов антикоагулянтную кровь в РСЛЛ берут с
а) физиологическим раствором натрия хлорида;
б) ППД-туберкулином для млекопитающих;
в) ППД-туберкулином для птиц;
При этом кролики, давшие положительную РСЛЛ с ППД-туберкулином для млекопитающих, считаются инфицированными бычьим видом возбудителя туберкулеза, а с ППД-туберкулином для птиц - зараженными птичьим видом возбудителя, с КАМ - сенсибилизированными атипичными нетуберкулезными микобактериями.
Целью изобретения является сокращение сроков обнаружения в организме животных возбудителя туберкулеза и определение вида микобактерий, вызвавшего сенсибилизацию.
Достижение поставленной цели основано на явлении немедленного приобретения после внедрения возбудителя иммунокомпетентными клетками повышенной чувствительности организма, выявляемой при повторном воздействии вне организма того же антигена на лейкоциты крови. Повышенная чувствительность после инфицирования представляет собой клеточный феномен, в котором клетками-эффекторами, вступающими во взаимодействие с туберкулином вне организма, являются сенсибилизированные лейкоциты крови, что отличается от повышенной чувствительности замедленного типа (ПЧЗТ) организма, которая развивается у животных через 2-3 недели после заражения их возбудителем туберкулеза.
Осуществления способа
Способ ранней диагностики туберкулеза животных осуществляется следующим образом. В лунку планшета, содержащую 0,05 мл 3,8%-ного раствора цитрата натрия (гепарина, трилона Б или любой другой антикоагулянт) вносят 0,1 мл исследуемой крови и рабочую дозу туберкулина в объеме 0,05 мл (опытные пробирки). Контрольные пробирки заполняют в том же объеме физиологическим раствором без туберкулина. Кровь в лунках планшета инкубируют в течение 2 часов при t=37°C, встряхивая через каждые 30 минут. Затем из контрольной и опытной лунок по 0,02 мл крови переносят в лунку с 0,4 мл жидкостью Тюрка (3-5% раствор уксусной кислоты, подкрашенный несколькими каплями раствора метиленового синего) для разрушения эритроцитов и окраски ядер лейкоцитов. Подсчитывают число лейкоцитов (в камере Горяева) во всех лунках и рассчитывают показатели реакции специфического лизиса лейкоцитов (в процентах) по формуле
где Л к и Л о - абсолютное количество лейкоцитов в контрольной и опытной пробе. РСЛЛ считают положительной при показателе 10% и выше.
Пример 1. Рабочая доза туберкулинов
Схема опытов по определению рабочей дозы туберкулинов (соотношения антикоагулянта, крови и туберкулина)
В схеме опытов по определению рабочей дозы туберкулинов показано, что объемные соотношения антикоагулянта и крови в пробах оставались одинаковыми, а дозы туберкулинов возрастали: 0,05; 0,1 и 0,15 мл
| Таблица 1 Определение рабочей дозы туберкулинов (в среднем по группам) для КРС и свиней в РСЛЛ |
||||||||||||
| Доза антигена | КРУПНЫЙ РОГАТЫЙ СКОТ | СВИНЬИ | ||||||||||
| Количество лейкоцитов при взаимодействии «in vitro» (10 9// л) | РСЛЛ в % | Количество лейкоцитов при взаимодействии «in vitro» (10 9/ л) | РСЛЛ в % | |||||||||
| Физ.р-р | ППД, мл. | КАМ | ППД птиц | ППД, мл. | КАМ | ППД птиц | Физ. р-р | ППД мл. | ППД птиц | ППД мл. | ППД птиц | |
| 0,05 | 9,5 | 9,6 | 9,4 | 9,5 | -1% | 1% | 0 | 9,3 | 9,2 | 9,4 | 1% | 1% |
| 0,1 | 9,5 | 9,5 | 9,4 | 9,4 | 0% | 1% | 1 | 8,6 | 8,7 | 8,7 | 1% | 1% |
| 0,15 | 9,3 | 9,0 | 9,1 | 9,2 | 3% | 2% | 1 | 8,7 | 8,4 | 8,8 | 3% | 2% |
Как видно из табл.1 и 2, РСЛЛ во всех пробах не превышает 3% у крупного рогатого скота, свиней, 7,4% у собак и 2% у кроликов, поэтому экономнее в качестве рабочей дозы использовать дозу 0,05 мл туберкулина, т.к. РСЛЛ у нее оказалась ниже, чем при дозе 0,15. И величина ее была практически одинаковой для ППД млекопитающих, ППД птиц и КАМ.
Таким образом, рабочая доза туберкулинов определена величиной 0,05 мл для РСЛЛ.
Пример 2. Специфичность и активность РСЛЛ крови бычков, вакцинированных БЦЖ-1
В опытах на 4-6-месячных бычках изучали специфичность и активность РСЛЛ. Для этого животным вводили живые микобактерии вакцинного штамма БЦЖ-1 в прививочных дозах: 0,05 мг, 0,15 мг, 0,25 мг и 0,50 мг (одна, три, пять, десять доз), а затем исследовали кровь в РСЛЛ в день вакцинации и через каждые 24 часа в течение 10 суток (240 часов).
Количество лейкоцитов в пробах крови с ППД для млекопитающих колебалось от 8,2 до 9,1·10 9 /л. Отличительно, что в пробах крови от бычков, вакцинированных БЦЖ, при взаимодействии с ППД для млекопитающих отмечали снижение количества лейкоцитов через 48-120 часов после введения вакцины по сравнению с другими пробами, однако число их было в границах нормы.
В эти же часы после введения живых микобактерий в пробах крови с физиологическим раствором ППД для птиц и КАМ количество лейкоцитов практически было одинаковым и колебалось от 9,2 до 11,3·10 9 /л, т.е. обнаруживали лейкоцитоз, который был тем сильнее, чем больше была прививочная доза микобактерий вакцинного шт. БЦЖ-1.
Как видно из табл.3, в пробах крови с ППД для млекопитающих положительная РСЛЛ обнаруживалась уже через 24 часа после сенсибилизации КРС вакциной БЦЖ, в пробах крови с ППД для птиц и КАМ показатели РСЛЛ были отрицательными.
| Таблица 3 Показатели РСЛЛ у крупного рогатого скота сенсибилизированного вакциной БЦЖ с туберкулинами: ППД для млекопитающих, ППД для птиц и КАМ |
||||||||||||
| Время после вакцинации, ч | ||||||||||||
| Одна (0,05 мг) | Три (0,15 мг) | Пять (0,25 мг) | Десять (0,50 мг) | |||||||||
| ППД мл. | ППД пт. | КАМ | ППД мл. | ППД пт. | КАМ | ППД мл. | ППД пт. | КАМ | ППД мл. | ППД пт. | КАМ | |
| в день сенсибилизации | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 1,2 | 0 | 1 | 0 | 0 | 1 |
| 24 | 14 | 0 | 1 | 14,3 | 0 | 0 | 16,2 | 1 | 1 | 34,3 | 1 | 1 |
| 48 | 27 | 0 | 0 | 32,5 | 0 | 0 | 28,6 | 1 | 0 | 48,3 | 0 | 0 |
| 72 | 23 | 0 | 1 | 25,5 | 0 | 1 | 21,6 | -1 | 1 | 41,3 | -1 | 1 |
| 96 | 17 | 0 | 0 | 10,8 | 0 | 0 | 19,5 | 0 | 0 | 35 | 0 | 1 |
| 120 | 13 | 0 | 0 | 5 | 1 | 0 | 10,3 | 0 | 0 | 24,2 | 0 | 1 |
| 144 | 7 | 1 | 1 | 1 | 0 | 0 | 6,3 | 0 | 1 | 20 | 1 | 1 |
| 168 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 2,4 | 0 | 1 | 15,1 | 0 | 1 |
| 192 | 1 | 0 | 0 | 1,2 | 0 | 1 | 8,6 | 0 | 1 | |||
| 216 | 0 | 0 | 0 | 6 | -1 | 1 | ||||||
| 240 | 0 | 0 | 0 | |||||||||
| - ППД пт. - ППД для птиц |
Полученные результаты исследований свидетельствуют о специфичности РСЛЛ. РСЛЛ может быть использована для выявления животных, сенсибилизированных микобактериями с антигенами, родственными туберкулину.
Активность РСЛЛ характеризуется тем, что с повышением дозы живых микобактерий вакцинного шт. БЦЖ-1 с 0,05 мг до 0,50 мг на животное возрастает показатель РСЛЛ.
Так, установлено, что при вакцинации одной прививочной дозой БЦЖ-1 наибольший показатель РСЛЛ с ППД для млекопитающих был через 48-72 ч после инъекции (27-23%)
При сенсибилизации крупного рогатого скота тремя прививочными дозами положительные показатели РСЛЛ также наблюдаются в это же время. Максимальный процент лизиса достигает 32,5% после введения вакцины БЦЖ.
При введении животным пяти прививочных доз лизис лейкоцитов был более продолжительным и имел тенденцию к увеличению показателя. Особенно четко эта тенденция наблюдалась при введении животным 10 прививочных доз вакцины БЦЖ, когда лизис лейкоцитов через 48 часов после инъекции вакцины достигал 48,3% и был более продолжительным, т.е. с увеличением количества прививочных доз процент сенсибилизированных лейкоцитов возрастал и это сказывалось на показателях РСЛЛ (табл.3).
Результаты показателей РСЛЛ в зависимости от количества прививочных доз вакцины БЦЖ-1 свидетельствуют о выраженной активности РСЛЛ.
Так, среднесуточный показатель РСЛЛ с ППД для млекопитающих за 120 часов при одной прививочной дозе микобактерии БЦЖ составил 18,8%, трех - 20,8%, пяти - 19,24% и десяти - 32,2%. При десяти прививочных дозах БЦЖ положительные показатели РСЛЛ с ППД для млекопитающих удлиняются до семи суток.
Выполненные исследования с инъекциями живых микобактерии вакцинного шт. БЦЖ позволили установить специфичность и активность РСЛЛ, что необходимо для дифференциальной диагностики специфических и неспецифических реакций на туберкулин.
Пример 3. Исследование по определению у свиней сенсибилизации, вызванной введением живых микобактерий вакцинного шт. БЦЖ-1
Опыты выполняли на поросятах-отъемышах трех групп, которым инъекцировали по одной, три и пять прививочных доз вакцины БЦЖ. Количество лейкоцитов у сенсибилизированных свиней одной дозой вакцины БЦЖ с ППД для млекопитающих колебалось от 7,2 до 8,8·10 9 /л, а с физиологическим раствором ППД для птиц колебания составляли от 8,7 до 14,3·10 9 /л. Наибольшее количество лейкоцитов было через 48 часов после вакцинации. Та же закономерность отмечалась при введении трех и пяти прививочных доз вакцины БЦЖ, где количество лейкоцитов с физиологическим раствором и ППД для птиц через 48 часов достигало 15,4 и 18,6·10 9 /л соответственно. В результате показатель РСЛЛ с ППД для млекопитающих у сенсибилизированных свиней через 24 часа при одной прививочной дозе составил 26,9%, трех - 28,9%, пяти - 38,1%. Наибольший показатель РСЛЛ был через 48-72 часов после сенсибилизации и составил 46,6-49,7%; 41,5-46,7%; 49,7-55,4% соответственно дозам (табл.4).
| Таблица 4 Показатели РСЛЛ у свиней, сенсибилизированных вакциной БЦЖ с туберкулинами: ППД для млекопитающих, ППД для птиц |
||||||
| Время после вакцинации, ч | Количество прививочных доз вакцины БЦЖ | |||||
| Одна (0,05 мг) | Три (0,15 мг) | Пять (0,25 мг) | ||||
| ППД мл. | ППД птиц | ППД мл. | ППД птиц | ППД мл. | ППД птиц | |
| в день сенсибилизации | -1 | 0 | 0,9≈1 | 0 | 0 | 1 |
| 24 | 26,9 | 1 | 28,9 | 1 | 38,1 | 0 |
| 48 | 49,65 | 1 | 46,7 | 1 | 55,4 | 0 |
| 72 | 46,61 | 0 | 41,5 | 1 | 49,7 | 1 |
| 96 | 34,45 | 0 | 26,9 | 1 | 19 | 0 |
| 120 | 17,82 | 0 | 20,9 | 1 | 13 | 0 |
| 144 | 1,15 | -1 | 7,8 | 0 | 6,4 | 1 |
| 168 | 0 | 0 | 1,8 | 1 | 1,8 | -1 |
| 192 | 0 | 1 | ||||
| - ППД мл. - ППД для млекопитающих | ||||||
| - ППД пт. - ППД для птиц |
У вакцинированных поросят положительные показатели РСЛЛ обнаруживали через 24-120 часов после введения одной, трех и пяти прививочных доз вакцины БЦЖ.
РСЛЛ с ППД для птиц была отрицательной, что подтверждает специфичность РСЛЛ с ППД для млекопитающих.
Пример 4. Исследование по определению у собак сенсибилизации, вызванной введением живых микобактерий вакцинного шт. БЦЖ-1
В опытах на собаках после введения одной, трех, пяти прививочных доз вакцины БЦЖ установлено, что через 24-72 часа при взаимодействии крови с физиологическим раствором численность лейкоцитов составила 5,2-6,2 10 9 /л, а с ППД для млекопитающих 3,4-4,7 10 9 /л, т.е. отмечалась лейкопения.
Количество лейкоцитов с физиологическим раствором было увеличено по сравнению с нормой в два и более раз. В результате показатели РСЛЛ составили при одной дозе 14-25%, при трех 20,8-60,6%, при пяти 22-68%. Наибольший показатель РСЛЛ был через 48 часов после вакцинации. Положительные показатели РСЛЛ отмечали при одной дозе через 24-96 часов, при трех через 24-120 часов, при пяти через 24-240 часов, т.е. с увеличением дозы вакцины увеличивалась продолжительность сенсибилизации лейкоцитов и возрастала активность - показатели РСЛЛ (табл.5).
| Таблица 5 Показатели РСЛЛ у собак и кроликов, сенсибилизированных вакциной БЦЖ |
|||||||||
| Время после вакцинации (час) | Количество прививочных доз вакцины БЦЖ | ||||||||
| СОБАКИ | КРОЛИКИ | ||||||||
| одна (0,05 мг) | три (0,15 мг) | пять (0,25 мг) | пять (0,25 мг) | десять (0,50 мг) | |||||
| ППД мл. | ППД мл. | ППД мл. | ППД мл. | ППД птиц | КАМ | ППД мл. | ППД птиц | КАМ | |
| В день сенсибилизации | 1 | 0 | 0,7 | 1 | 0 | 1 | 0 | 0 | 1 |
| 24 | 24 | 45,9 | 60,5 | 58 | 1 | 0 | 56 | 1 | 0 |
| 48 | 25 | 60,6 | 68 | 71 | 0 | 0 | 72 | 0 | 0 |
| 72 | 23 | 50 | 63,8 | 71 | 0 | 1 | 41 | 1 | 0 |
| 96 | 14 | 43,6 | 62,6 | 36 | 1 | 0 | 26 | 1 | 0 |
| 120 | 1,9 | 20,8 | 57,4 | 2 | 0 | 1 | 30 | 0 | 1 |
| 144 | 1 | 3,4 | 54,9 | 0 | 1 | 0 | 25 | 0 | 0 |
| 168 | 1 | 1 | 41,2 | 0 | 0 | 0 | 19 | 0 | 1 |
| 192 | 0 | 0 | 0 | 0 | 17 | 1 | 1 | ||
| 216 | 32 | 0 | 0 | 1 | 17 | 0 | 0 | ||
| 240 | 22 | 0 | 1 | 0 | 13,7 | 0 | 0 | ||
| 264 | 0 | 0 | 1 | 1 | 16,0 | 1 | 0 | ||
| 288 | 1,4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | ||
| 336 | 1 | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 | |||
| 408 | 23 | 1 | 1 | ||||||
| 672 | 1 | 0 | 0 | ||||||
| - ППД мл. - ППД для млекопитающих | |||||||||
| - ППД пт. - ППД для птиц |
Пример 5. Исследование по определению у кроликов сенсибилизации, вызванной введением живых микобактерий вакцинного шт. БЦЖ-1
При вакцинации кроликов пятью прививочными дозами вакцины БЦЖ самое низкое содержание лейкоцитов в крови при взаимодействии с ППД для млекопитающих обнаруживали через 24 и 72 часа (4,6-4,7 10 9 /л), а при десяти дозах наименьшее количество лейкоцитов при взаимодействии с ППД для млекопитающих было через 24 часов (3,8 10 9 /л) и 48 часов (4, 7 10 9 /л). Особенностью является то, что при взаимодействии крови с ППД для млекопитающих через 72-264 часа и через 408 часов после вакцинации количество лейкоцитов было в несколько раз выше, чем в норме, и составляло 11-28,5 10 9 /л, т.е. вместо лейкопении отмечался лейкоцитоз. И в это же время количество лейкоцитов в пробах с физиологическим раствором (контрольные пробы) значительно превышало численность их в опытных пробах и составляло 25,0-38,7 10 9 /л. Установлено, что на фоне лейкоцитоза, вызванного введением больших доз вакцины БЦЖ, РСЛЛ у кроликов была положительной и составляла от 13,7 до 72% (табл.5).
Пример 6. Исследование проб крови РСЛЛ коров, давших дважды положительную реакцию на туберкулин
Диагностику туберкулеза реакций специфического лизиса лейкоцитов РСЛЛ в производственных условиях выполняли в СПК « Рассвет» Матвеево-Курганского района.
В октябре 2006 г. на ранее благополучной ферме положительно прореагировали на туберкулин семь коров из 198 исследованных. При повторной туберкулинизации через 45 дней они вновь дали положительную реакцию. При внутрикожном введении туберкулина образовывались тестоватой консистенции разлитые припухлости, кожная складка утолщалась на 5-10 мм.
Перед убоем коров взяли кровь для исследования в реакции специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ). Результаты исследований по количеству лейкоцитов и показателям РСЛЛ у коров, с выраженной реакцией на туберкулин, представлены в табл.6.
| Таблица 6 РСЛЛ и патологоанатомические данные у коров, положительно прореагировавших на туберкулин |
|||||||
| Инвентарные номера коров | Кол-во лейкоцитов и показатель РСЛЛ крови при взаимодействии с | ||||||
| Физиологич. раствор | ППД для мл. | ППД для птиц | КАМ | ||||
| кол-во лейк. | кол-во лейк. | РСЛЛ% | кол-во лейк. | РСЛЛ% | кол-во лейк. | РСЛЛ% | |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| 6827 | 7,7 | 5,5 | 29 | 7,6 | 1 | 7,55 | 2 |
| 071 | 11,0 | 7,1 | 36 | 11,0 | 0 | 10,5 | 1 |
| 4006 | 5,05 | 5,0 | 1 | 5,0 | 1 | 5,05 | 1 |
| 4018 | 9,5 | 2,75 | 71 | 9,35 | 2 | 9,4 | 1 |
| 162 | 5,0 | 4,8 | 4 | 4,9 | 1 | 4,9 | 1 |
| 109 | 5,0 | 4,9 | 2 | 5,0 | 0 | 4,9 | 1 |
| 148 | 5,75 | 4,2 | 27 | 5,7 | 1 | 5,7 | 1 |
Как видно из табл.6, из семи коров, реагировавших на внутрикожное введение туберкулина, только у четырех РСЛЛ была положительна (инвен. №6827; №071; №4018; №148) при взаимодействии проб крови с ППД-туберкулином для млекопитающих. Пробы крови с ППД-туберкулином для птиц и КАМ дали отрицательные показатели РСЛЛ.
Ветеринарная экспертиза контрольно-диагностического убоя положительно реагирующих на туберкулин коров показала, что из четырех животных с положительными показателями РСЛЛ только у двух обнаружены в лимфатических узлах изменения, характерные для туберкулеза: у одной туши в подчелюстных и заглоточных, а у второй средостенных и брыжеечных лимфатических узлах. В тушах двух коров с положительной реакцией на туберкулиновую пробу и положительными показателями РСЛЛ патологоанатомических изменений, характерных для туберкулеза, во внутренних органах и лимфатических узлах визуально не обнаружено. Это, вероятно, связано с недавним инфицированием животных возбудителем туберкулеза, и патологоанатомические изменения еще не успели сформироваться. Кроме этого, при послеубойной контрольно-диагностической экспертизе было установлено, что положительные реакции на внутрикожное введение туберкулина дали две глубокостельные (7-8,5 мес. беременности) коровы и одна с острым эндометритом при стрептококковой инфекции. Патологоанатомические изменения у положительно прореагировавших на туберкулин коров показаны в табл.7.
| Таблица 7 Патологоанатомические изменения у положительно прореагировавших на туберкулин коров |
|
| Номер коров | Патологоанатомические изменения |
| 6827 | Патологоанатомических изменений во внутренних органах и лимфатических узлах не обнаружено |
| 071 | Надартериальный лимфатический узел гиперимирован, печеночный лимфатический узел на разрезе имеет саловидные фокусы, других патологоанатомических изменений во внутренних органах и лимфатических узлах не обнаружено |
| 4006 | Послеродовой эндометрит, других патологоанатомических изменений во внутренних органах и лимфатических узлах не обнаружено |
| 4018 | Подчелюсной левый лимфатический узел на разрезе имел некротические фокусы серо-белого цвета, других патологоанатомических изменений во внутренних органах и лимфатических узлах не обнаружено |
| 162 | Патологоанатомических изменений во внутренних органах и лимфатических узлах не обнаружено, стельность 7 месяцев |
| 109 | Патологоанатомических изменений во внутренних органах и лимфатических узлах не обнаружено, стельность 7,5 месяцев |
| 148 | Патологоанатомических изменений во внутренних органах и лимфатических узлах не обнаружено, стельность 8 месяцев |
Контрольно-диагностическая экспертиза убитых коров, реагировавших положительно на туберкулин, показала, что в четырех случаях из семи положительная туберкулиновая проба совпадала с положительной РСЛЛ (В=4:7=0,57); в одном случае (В=1:7=0,14) из трех коров с беременностью 7-8 мес. положительная туберкулиновая проба совпала с глубокостельностью (8 мес.; В=1:3=0,33); в одном случае - со стрептококковой инфекцией (острый эндометрит; В=1:7=0,14).
РСЛЛ в двух случаях из четырех положительных показателей совпадала с обнаружением патологоанатомических изменений, характерных для туберкулеза (В=2:4=0,5), и в двух случаях из четырех (В=2:4=0,5) визуальных патологоанатомических данных не обнаружено, что не может быть основанием для исключения раннего инфицирования микобактериями, когда еще патологоанатомические изменения не сформировались.
Литература
1. Диагностика туберкулеза. // В.П.Урбан, М.А.Сафин, А.А..Сидорчук, М.В.Харитонов, Р.С.Сигбатулин, Ф.Г. Акберов. // Практикум по эпизоотологии и инфекционным болезням с ветеринарной санитарией. Учебник. Москва: «Колос», 2003, с.82-86.
2. Эпизоотологический контроль и постановка диагноза на туберкулез у животных разных видов. Профилактика и борьба с заразными болезнями, общими для человека и животных. Сборник санитарных и ветеринарных правил. Изд. официальное. Госкомсанэпиднадзор России. Минсельхозпром России. Москва. 1996, с.164-167.
3. Наставление по проведению симультанной пробы с применением туберкулина и комплексного Аллергена из атипичных микобактерий (КАМ) при диагностике туберкулеза животных. Ветеринарное законодательство. Том 3. Москва: «Колос», 1981, с.220-224.
4. Шаров А.Н. Туберкулез «Ветеринарные препараты» Справочник (под ред. д.б.н. Д.Ф.Осидзе). Москва: «Колос», 1981, с.192-201.
1. Способ ранней диагностики туберкулеза животных, включающий выявление в благополучных хозяйствах и дворах плановыми аллергическими исследованиями реагирующих на туберкулин животных, отличающийся тем, что от положительно реагирующих на туберкулин животных исследуют кровь реакцией специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ) с использованием в качестве диагностикума туберкулинов ППД для млекопитающих, ППД для птиц и КАМ.
2. Способ ранней диагностики туберкулеза по п.1, отличающийся тем, что при диагностике туберкулеза у крупного рогатого скота РСЛЛ проводят с ППД-туберкулином для млекопитающих, ППД-туберкулином для птиц и КАМ-комплексным аллергеном из атипичных микобактерий.
3. Способ ранней диагностики туберкулеза по п.1, отличающийся тем, что при диагностике туберкулеза у свиней РСЛЛ выполняют с ППД-туберкулином для млекопитающих и ППД-туберкулином для птиц.
// 2341288 // 2443428
Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии
Изобретение относится к области биотехнологии